金银花组织培养外植体灭菌方法的研究

·中药农业·

金银花组织培养外植体灭菌方法的研究

韩笑，王娜，张玲，李佳

山东中医药大学，山东

济南

1*

250355

［摘要］近年来金银花的需求量不断上升，价格呈现攀高的趋势，金银花种苗价格也不断升高。大田生产中大多通过扦插和分根等方式进行繁殖，但品质却不断下降。如何快速得到大批量、高品质和低成本的种苗，组织培养是最好的方式之一。本实验通过使用不同浓度的碱化乙醇和0.1%的氯化汞进行灭菌处理，通过试验发现经质量分数为0.1%氯化汞7min处理后灭菌效果最佳，成活率能达到88.3%，污染率低至8.3%。同时，经过初步清洗处理后接种于含0.1%纳米银分子的培养基中的外植体更是达到了98.3%的灭菌率，成活率高达96.7%。这种低成本高效的灭菌方式有利于脱毒苗的大批量生产，为大田生产提供了便利条件。

［关键词］金银花；组织培养；外植体；灭菌方法［中图分类号］Q813.1；Ｒ282.71

［文献标识码］A

［4890（2019）03-0338-04文章编号］1673-doi：10．13313/j．issn．1673-4890．20180911003

StudyonSterilizationMethodofTissueCultureExplantsofLonicerajaponica

HANXiao，WANGNa，ZHANGLing，LIJia1*

ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China

［Abstract］

Inrecentyears，thedemandofhoneysuckle（LoniceraeFlos）hasbeenincreasing，andthepriceofseed-

lingshasbeenrising.Inthefield，mostofthemarepropagatedbycuttageplantingandrootsplitting，butthequalityisdecrea-sing.Tissuecultureisoneofthebestwaystogetmass，highqualityandlowcostseedlingsquickly.Inthisexperiment，differ-entconcentrationsofalkalizedethanoland0.1%mercuricchloridewereusedtosterilize.Itwasfoundthatthebeststerilizationeffectwasobtainedafter7minutesof0.1%mercuricchloridetreatmentinsinglefactorexperiment.Thesurvivalratewas88.3%andthepollutionratewas8.3%.Atthesametime，theexplantsinoculatedinthemediumcontaining0.1%silvernan-oparticlesaftersimplepreliminarycleaningtreatmentreached98.3%sterilizationrate，andthesurvivalratewasashighas96.7%.Thislowcostandhighefficiencysterilizationmethodisconduciveformassproductionofvirus-freeseedlings，andpro-videsconvenientconditionsforfieldproduction.

［Keywords］

Lonicerajaponica；tissueculture；explant；sterilizationmethod

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicerajaponica

Thunb的干燥花蕾或带初开的花［1］，富含酚酸类、环烯醚萜类、黄酮类、糖类挥发油类及微量元素等多种成分，有抑菌抗炎，抗氧化等多种生理活性，

［2-3］。有清热解毒、治疗热毒血痢、痈疽疔毒的功效

由于忍冬繁殖能力强，对土壤和气候的选择并不严

的关注度更是增高。植物组织培养是指在无菌环境下，利用植物离体的细胞，组织或器官在人工培养的条件下生成新的植物体的过程。组织培养能在较短的时间内繁殖出大量的植株，有快速、高效的作用。同时，对于金银花等容易携带病毒，易于退化的植物来说，组织培养可以保持其亲本的优良性状，维持良好品质

［4］

格，全国各地均有种植，且以河南的“密银花”和

山东的“济银花”最为出名。目前在大田生产中主要以扦插和分根繁殖为主。由于近年来金银花价格走势不断上升，运用范围不断拓宽，药农对金银花

。在组织培养过程中，面临的主要

问题之一便是外植体的杂菌感染，如何将外植体进行有效的灭菌，从而得到大批量无菌苗，应用于大田生产，得到量大、价低且品质好的金银花品种是

*

［通信作者］mail：LJYTL7172@163.com李佳，教授，研究方向：中药资源与质量控制研究；E-

·338·

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我们一直努力的方向。1

材料与方法

1.1实验材料

金银花：采于山东中医药大学药圃，由山东中

医药大学李佳教授鉴定品种为“金华三号”。主要试剂：MS干粉培养基，无水乙醇，氯化

汞，纳米银（直径为120nm），琼脂粉，蔗糖，氢氧化钠，I-BA。高压灭菌锅，超声波清洗机，PH检测仪，无菌

操作台。1.2试验方法

1.2.1样品预处理取金银花新生幼嫩茎尖2～3cm长，用清水浸泡清洗10min后用吸水纸擦干，再用质量分数为1.0%的洗衣粉溶液浸泡20min后再用清水冲洗30min，用吸水纸擦干剪掉茎底部变色发黑部分，处理后长约为2cm茎尖为备用外植体。

1.2.2样品灭菌方式

我们选择灭菌和抑褐效果较

好的乙醇和氯化汞为灭菌剂［5］

。

1.2.2.1碱化乙醇处理将预处理后的外植体正交实验优选出实验方案，将乙醇浓度，氢氧化钠质量分数，处理时间和温度为影响因素，污染率，褐化率和成活率作为评价标准，采用四因素三水平进行比较。正交实验因素水平表见表1，正交实验结果及分析见表2。使用乙醇浓度分别为70%、75%、80%；氢氧化钠质量分数分别为0.5%、1.0%、1.5%；处理时间分别为20、30、40s；处理温度分别为20、25、30℃。经优化得到L4

9（3）的正交试验。

表1

正交实验因素水平表

水平因素

乙醇浓度/%

处理时间/s

氢氧化钠质量分/%

温度/℃170200.520275301.0253

80

40

1.5

30

1.2.2.2氯化汞处理使用质量分数为0.1%的氯化汞溶液，处理时间分别为5、6、7、8min。1.2.2.3混合处理A处理：乙醇浓度75%，氢氧化钠质量分数为1.0%的碱化乙醇处理30s+质量分数0.1%氯化汞7min。

B处理：直接将备用外植体用无菌水冲洗3遍

并用无菌吸水纸擦干后接种到1/2MS+0.7%琼脂+3.0%蔗糖+0.1%纳米银+3.0mg·L－1IBA的培养基上。

C处理：将备用外植体用无菌水冲洗3遍并用无菌吸水纸吸净水分后接种于1/2MS+0.7%琼脂+

3.0%蔗糖+3.0mg

·L－1IBA银的培养基上。每个处理接种20瓶，重复三次。

1.2.3培养基类型a型：1/2MS+0.7%琼脂+3.0%

蔗糖+3.0mg

·L－1IBA［6］b型：1/2MS+0.7%琼脂+3.0%蔗糖+0.1%纳米银+3.0mg

·L－1IBA培养基pH在5.8～6.0之间。

1.2.4培养环境将接种后的外植体置于无菌组织培养室中，温度25℃左右，湿度60%，光照2000lx，光照时间16h·d－1。培养15d内看污染情况，30d内看死亡及褐化情况并及时做好记录。

污染率=染菌外植体数

接种外植体数

×100%

（1）褐化率=

褐化外植体数

接种外植体数×100%

（2）成活率=

1－死亡外植体数

接种外植体数×100%（3）

2

结果与分析

2.1不同灭菌处理后灭菌效果

2.1.1碱化乙醇处理效果由于金银花外被疏绒毛和疏腺毛，灭菌较为困难。在灭菌剂中加入适量的氢氧化钠，可增大灭菌剂与金银花表面的接触面积，提高灭菌率。

在实验中我们发现，乙醇浓度低，灭菌时间短都可能造成灭菌不彻底，污染率就相应增高，乙醇

浓度过高，灭菌时间增长则使外植体褐化率增高，成活率降低，而氢氧化钠的浓度过高则过分破坏了金银花表面，使其褐化率增高。根据表2可知，处理时间的极差值最高为1.314，为四个因素中最重要因素。本实验中最适处理时间为30s。实验五中氢氧化钠的质量分数为1.0%，处理时间为30s，乙醇的浓度为75.0%，温度为25℃时外植体污染率和褐化率较低，成活率最高，为最优灭菌方法。

实验结果=污染率×0.3+褐化率×0.3+成活率×0.4（4）

·339·

2019年3月第21卷第3期

表2

中国现代中药ModChinMedMar.2019Vol.21No.3

碱化乙醇对顶芽灭菌正交实验安排及结果

NAOH12323131234.44333.95735.1071.150

温度12331223134.53734.55034.4200.130

污染率58.350.046.746.740.041.751.755.048.3

褐化率6.78.311.716.710.011.713.311.718.3

成活率33.341.743.336.751.748.336.735.035.0

实验结果33.3334.1734.8433.7236.3035.3034.1834.7033.98

因素实验1实验2实验3实验4实验5实验6实验7实验8实验9均值1均值2均值3极差

乙醇浓度

11122233334.11335.10734.2870.994

处理时间

12312312333.74335.05734.7071.314

通过表3我们可以看出，处理时间对金银花外植体灭菌处理结果的影响达到极显著水平，乙醇浓度和氢氧化钠质量分数对金银花外植体灭菌处理结果的影响达到显著水平，温度对金银花外植体灭菌处理结果的影响不显著。

表3

因素乙醇浓度处理时间NAOH质量分数温度误差

果［7］。且通过表2和表5对比，我们发现，0.1%的氯化汞灭菌效果远远高于乙醇，且对外植体的破坏较小，成活率更高。

表5

处理时间/min

5

11.710.08.36.7

氯化汞对顶芽灭菌效果

褐化率/%3.35.05.08.3

成活率/%85.085.088.386.7

实验结果38.538.539.539.2

污染率/%

正交设计方差分析表

F比54.48489.51664.4841.000

F临界值显著性19.00019.00019.00019.000

***

22222

偏差平方和自由度1.6892.7751.9990.0310.03

678

2.1.4混合处理灭菌效果

通过表6我们发现，A处

理是将碱化乙醇和氯化汞相结合进行处理，得到的外植体灭菌效果确实有所增加，但褐化率也有一定程度的上升，我们认为，可能是较长时间的试剂处理使外植体外表损坏增大，从而使褐化率增加，成活率有一定的下降。在表六这几个处理中，不难发

注：*表示P＜0.05。

2.1.2验证实验最佳方案（实验5）进行三批实验验证，得出实验结果如表4所示，三次结果同实验五结果比较变动较小，说明结果稳定。

表4

序号123

污染率/%41.740.041.7

最佳方案验证实验

褐化率/%10.08.310.0

成活率/%53.353.351.7

验证结果36.8335.8236.19

现，B处理是效果最好的处理方式，污染率低至1.7%，褐化率为3.3%，成活率高达96.7%。在B处理过程中，我们最小化的降低对外植体的破坏，只将其外带的细菌病毒等杀灭，然后接种于含有纳米银的培养基上，就达到了较好的效果。将B处理与C处理对照，两者之间差别为是否含纳米银分子，显而易见，纳米银在抑制杂菌生长方面有着较为显著地效果。纳米银是直接通过损伤细菌的细胞壁、细胞膜甚至对细菌的代谢产生影响来达到抑菌的作用。且纳米银具有无耐药性，无毒无害，广泛应用于临床试验中

［8-9］

2.1.3氯化汞处理效果氯化汞是灭菌效果较强的

灭菌剂，灭菌时所需浓度较低。通过表5我们不难发现，用0.1%的氯化汞处理7min时，外植体的污染率和褐化率处在一个相对较低的水平，成活率达到88.3%，这一试验也验证了文明玲等的研究结·340·

。从C处理中我们也可以发现，破

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坏较小的外植体褐化率较低，且其污染率及成活率也是有一定的参考之处。因此笔者认为，金银花外植体含有的成分绿原酸等具有抑菌抗病毒的作用，从而使得金银花外植体自身产生抵抗外界杂菌病毒的机制，使其污染率到达一个与表2中1号处理几乎持平的效果。

采用不同浓度，不同质量分数、不同处理时间的碱化乙醇灭菌实验，找到最优方案再与氯化汞处理相结合达到最优的灭菌结果。

表6

混合处理对顶芽的灭菌效果

不同处理

污染率/%

褐化率/%成活率/%实验结果A5.08.3088.339.2B1.73.396.740.1C

54.0

5.0

36.0

32.1

3结论与展望

金银花外植体灭菌方式多种多样，外被疏绒毛、

疏腺毛等特征，使得灭菌方法与其他植物相比有所不同。试剂处理后最佳灭菌方式为浓度75.0%乙醇与质量分数1.0%氢氧化钠混合形成碱化乙醇处理30s加质量分数0.1%氯化汞处理7min得到污染率5.0%，成活率88.3%的处理方式。考虑到大田生产的成本问题，0.1%的氯化汞处理7min则更为合适。

同时，本实验中最优灭菌方法为在含有纳米银的b型培养基上接种经无菌水冲洗干净的外植体，可以达到98.7%的灭菌率，96.7%的成活率。

随着科技的发展，试验水平和仪器设备标准的提升，无菌处理以及组织培养技术将会达到一个更高的水平。

参考文献

1］国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部［M］．北京：

中国医药科技出版社，

2015．2］宋亚玲，倪付勇，赵祎武，等．金银花化学成分研究进

展［

J］．中草药，2014，45（24）：3656-3664．3］王亚丹，杨建波，戴忠，等．中药金银花的研究进展［J］

．药物分析杂志，

2014，34（11）：1928-1935．4］刘国良．金银花繁殖技法［N］．云南科技报，2009-04-13（6）．5］戴莹，杨世海，赵鸿峥，等．药用植物组织培养中褐化现

象的研究进展［

J］．中草药，2016，47（2）：344-351．6］刘敏杰．金银花组织培养与快速繁殖研究［J］．安徽农学

通报，

2014，20（21）：21-22．7］文明玲，乐正碧，徐茜，等．金银花组织培养外植体灭菌

方法探索［

J］．陕西农业科学，2011，57（2）：50-51，63．8］陈飞飞，陈芳艳，王叶云，等．纳米银灭菌机制及应用研

究进展［

J］．安徽农业科学，2016，44（9），28-30．9］汤京龙，奚廷斐，刘国权，等．高温灭菌工艺对纳米银颗粒

分散效果的影响［

J］．材料热处理学报，2009，30（3）：6-9．（收稿日期：2018-09-11编辑：姚霞）

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