酶催化作用的主要因素。4、简述蛋白质酶分类和命名的原则。5、简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法
酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程
酶研究的两个方向
一、酶学的理论研究
二、酶的应用研究（酶技术研究） 酶学是酶工程的理论基础，酶工程是
在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：对强酸碱敏感，稳定性差，只能使用一次，分离纯化困难等。 酶的改性
酶分类和命名的总原则根据酶作用的底物和催化反应的类型进行。蛋白类酶（P酶）
的分类与命名
推荐名一般由两部分组成：底物名称和催化反应的类型，后面加一个“酶”字。
系统命名包括了酶的作用底物、酶作用的基团及催化反应的类型。蛋白类酶（P酶）
的分类和命名
1、氧化还原酶2、转移酶3、水解酶4、裂合酶5、异构酶6、连接酶（合成酶） 一、酶活力 是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。 酶活力单位
1961年，规定：在最适反应条件下（温度可采用25℃），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。1IU = 1μmol/min 1972年，规定：在最适条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1kat。1Kat = 6 x 107 IU 酶的比活力：
指在特定条件下，单位质量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。
酶的转换数又称摩尔催化活性，是指每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。 催化周期：是指酶进行一次催化所需的时间转换数的倒数称为酶的催化周期。 固定化酶的概念与水不溶性载体结合、在一定的空间范围内起催化作用
的酶称为固定化酶。固定化酶的活力测定1、振荡测定法2、酶柱测定法3、连续测定法
1、优良产酶微生物应具备的条件。2、简述酶微生物合成的调节机制。3、对产酶
影响的发酵条件有哪些？ 4、何谓溶氧速率和耗氧速率？如何进行溶解氧的调控？ 5、试对酶的生物合成四种模式的特点进行比较？
一、优良产酶微生物应具备的条件
（1）酶产量高 （2）易培养（生长速率高、营养要求低） （3）遗传性能稳定，不易退化 （4）易分离提纯 （5）安全可靠（不是致病菌） 酶合成的调节机制
1、 酶合成的诱导。加入某些物质，使酶生物合成开始或加速进行。-半乳糖苷酶的作用底物乳糖及其底物类似物异丙基- - D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导-半乳糖苷酶的生物合成。
2.末端产物阻遏。 由酶催化反应的产物或代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。色氨酸操纵子——酶的阻遏
3.分解代谢物阻遏指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分
解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。葡萄糖效应 1、添加诱导物2、降低阻遏物浓度3、添加表面活性剂4、添加产酶促进剂
根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为4种类型，即：1同
步合成型酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定大部分组成酶的生物合成属于同步合成型 2延续合成型可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。
酶生产中最理想的合成模式
3中期合成型酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳
定的。
4滞后合成型受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。
在酶的工业生产中，还要摸索一系列工程和工艺条件，如培养基的灭菌方式，种子
培养条件，发酵罐的型式，通气条件，搅拌速度加温，冷却和pH等，还要研究酶的分离纯化技术和制剂工艺，这些条件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益。 发酵条件对产酶的影响(1) pH的调节控制（2）温度的调节控制（3）溶解氧的调节
控制
耗氧速率是指单位体积（L）培养基中的细胞在单位时间内所消耗的氧气量。 氧的溶解速度又称为溶氧速率或溶氧系数，以Kd表示（溶氧速率）。
Kd：单位体积的发酵液在单位时间内所能溶解的氧的量，单位（mmol氧/L〃h） 4、调节溶氧速率的方法
由于溶氧速率与通气量、氧的分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性
质等有密切关系，因此可从这5个方面来调节①调节通气量②调节氧的分压③调节气液接触时间④调节气液接触面积⑤培养液的特性对溶氧速率有明显作用
二1、微生物、动物和植物细胞之间的差异主要有哪些？ 2、简述动植物细胞培养
工艺条件及其控制措施？ 3、细胞培养的目的及其在研究工作中的意义？ 4、动植物细胞培养产酶有何特点？ 5、举例说明动植物细胞培养产酶的工艺过程植物、动物、植物细胞的特性（三者之间的差异） 植物细胞>动物细胞>微生物细胞。
动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。
植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。
植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。 植物细胞培养的工艺流程
1外植体2细胞的获取3细胞培养4分离纯化5分离纯化 培养条件的影响与控制
1、温度 室温范围（25℃左右） 2、pH 5.5~5.8 3、通气与搅拌 4、光照的控制 5、前体的添加
6、刺激物（elector）的应用 1、植物细胞培基的特点 需要大量的无机盐；
需要多种维生素和植物生长激素； 要求的氮源一般为无机氮；
以蔗糖为碳源，浓度为2%~5%。
应用最广的是MS培养基和LS培养基 植物细胞培养产酶实例
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例 (1)大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。 2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养10~12d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。
然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。 (3)酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶 动物细胞培养产酶的工艺过程
将种质细胞（主要有体细胞和杂交瘤细胞两大类）用胰蛋白酶消化处理，分散成悬浮细胞；再将悬浮细胞接入适宜的培养液中，在人工控制条件的反应器中进行细胞悬浮培养或者贴壁培养；培养完成后，收集培养液，分离纯化得到所需产物。 培养条件的影响与控制
（1）温度：一般控制在36.5℃.
（2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。 （3）渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 （4）溶解氧：根据情况随时调节。 动物细胞培养的特点 细胞生长速度慢。（需添加抗生素）
细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。 反应过程成本高，产品价格贵。
细胞具有锚地依赖性，适宜贴壁培养。 原代细胞一般繁殖50代。
四1、酶分离提取的基本原则。2、细胞破碎的方法主要有哪些？各有何特点？ 3、试述酶提取的主要方法。4、试述酶沉淀分离方法的原理与特点。5、离心机与离心方法的选择？ 6、过滤的分类及膜分离技术。7、萃取分离的基本概念。8、各种萃取方法的基本原理与操作技术。9、各种萃取分离的影响因素。 酶分离纯化工作的基本原则 1、防止酶变性失效 ①低温操作
②整个系统PH不过酸或过碱 ③减少泡沫形成
④注意重金属、有机溶剂、微生物及水解酶等对酶的破坏。
2、选择有效的纯化方法
3、酶活性测定贯穿纯化过程的始终 细胞破碎方法及其原理
提取方法
（一）盐溶液提取
常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取
（三）有机溶剂提取盐析沉淀法（改变离子强度） 盐析沉淀法（改变离子强度）
（一）1、基本原理（盐溶和盐析）
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in） ：
低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ：
高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度中性盐的选择 1) 常用（NH4）2SO4，其突出优点： a. 简便 b. 安全
c. 不易引起变性 d. 价格便宜
缺点：分辨率低，纯度提高不显著，有脱盐问题 2) 蛋白质浓度：1mg/ml以上 3) pH值：等电点处最易沉淀。 4) 温度的影响
一般可在室温下进行。
某些对温度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作
（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数）
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。 1、沉淀机理
降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2、常用有机溶剂
丙酮最好，乙醇和甲醇也多用。优缺点： 优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐
3）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：1）容易引起蛋白质变性失活
2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
（三）等电点沉淀(isoelectric precipitation) 1、原理
蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 （四）复合沉淀法 1、作用机理：
与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。 2、沉淀剂：
常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG ） 多用分子量为6000～20000的 PEG。 3、优点：
①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 ②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当 多的生物大分子。
③沉淀后有机聚合物容易去除。 （五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
⑴ 热变性
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 ⑵ pH变性
等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。 ⑶ 有机溶剂变性
使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。 （二）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速
常用离心方法 密度梯度离心 差速离心法 沉降速度法 沉降平衡法 等密度梯度离心
1.1差速离心 （differential centrifugation）
采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：操作简单、方便 。
缺点：1）分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。
2）离心后的颗粒沉降在管底，沉降的颗粒受到挤压。 样品的粗提纯和浓缩
2.密度梯度离心（速度区带离心） （density gradient centrifugation） 样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。
常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液，浓度范围5%~60%，密度范围1.02~1.30g/cm2。 适宜的密度梯度系统
3. 等密度梯度离心 又称平衡等密度离心 （sedimentation equilibrium centrifugation）。
根据颗粒的密度不同而进行分离。
离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。 等密度梯度离心特点：
介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。 根据过滤介质的不同，过滤分为：
一、非膜过滤（采用高分子膜以外的物质作为过滤介质） 1.粗滤 2.微滤
二、膜过滤（采用各种高分子膜为过滤介质） 1.加压膜分离 2.电场膜分离 3.扩散膜分离
过滤的分类及其特性 (过滤介质截留物质颗粒大小)
二、膜分离技术 借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。
萃取分离利用溶质在互不相溶的两相中溶解度不同而使溶质分离的技术。 一、有机溶剂萃取
料液：供提取的溶液。
溶质：料液中欲提取的物质 。
萃取剂 ：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂 。 萃取液 ：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与 萃取剂形成的溶液 。
萃余液：被萃取出溶质后的料液（以原溶剂为主） 。
反萃取：完成萃取操作后，将产物从有机相转入水相的萃取操作。 萃取是一种扩散分离操作，不同物质在两相中 分配平衡的差异是实现萃取分离的主要因素 1）混合 2）分离 3）溶剂回收 二、双水相萃取
又称水溶液两相分配技术，利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而分离。
双水相一般由按一定百分比组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成。双水相萃取过程中，关键是制备好双水相系统。制备双水相系统：
一、要选择适宜的溶质；
二、配制好溶液的浓度和两种溶液的比例。
1双水相的形成2溶质在双水相中的分配3双水相的分离 三、 超临界萃取
超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。在超临界流体萃取过程中，为了提高分离效果，往往在超临界流体中添加少量的另一种溶剂，如水、乙醇、丙酮等。这些少量的辅助溶剂又称为夹带剂。 超临界萃取基本过程：
1）在SCF中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。 2）降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。
四、 反胶束萃取
1. 反胶束又称反胶团，是表面活性剂分散于连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。 2、萃取过程
第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。
第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，实现对蛋白质的反萃取过程。 （1）表面活性剂
常用： AOT(Aerosol OT)（阴离子表面活性剂，丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠）。特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。 （2） 非极性有机溶剂
环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。
五1、何谓固定化酶？固定化酶的优缺点？ 2、酶的固定化方法有哪些？ 3、固定化酶的特性有哪些？ 4、举例说明固定化酶在工业上的应用。5、何谓固定化细胞？固定化细胞有何特点？ 6、简述固定化原生质体制备的方法与特点。
1、固定化酶(immobilized enzyme 固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。
酶的固定化（enzyme immobilization） 优点：
不溶于水，易于与产物分离 可反复使用 可连续化生产 稳定性好 缺点：
(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。
（一）酶的固定化方法
1吸附法2吸附法a凝胶包埋法 b半透膜包埋法结合法
3结合法a离子键结合法b共价键结合法4交联法5热处理法 固定化酶的特性 1、稳定性 2、最适温度 3、最适PH 4、底物特异性 固定化酶的应用
（一）在工业生产上的应用 1. 氨基酰化酶
世界上第一种工业化生产的固定化酶 2、葡萄糖异构酶
世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。
通过各种方法将细胞固定在水不溶性的载体上，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。
固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。 固定化细胞的特点 优点：
1）免去破碎细胞提取酶的复杂过程； 2）酶在细胞内环境中，稳定性更高； 3）可催化较复杂的反应； 4）制备成本低。 缺点：
1）对底物和产物有一定限制； 2）产物较复杂，有副反应。 原生质体的制备
将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——酶解去细胞壁—分离纯化——得到原生质体———活性鉴定 固定化原生质体的特点
固定化原生质体保留了细胞膜及其内部结构，保持了细胞原有的新陈代谢特性。 解除了细胞壁可增加细胞膜的通透性，有利于氧与营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率；
由于有载体的保护，具有较好的操作及保存稳定性，可反复或连续使用较长时间； 易于和发酵物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量；
加入的渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。 六1、试述酶分子修饰的概念和意义。2、何谓金属离子臵换修饰？简述其主要修饰
过程和作用。3、何谓大分子结合修饰？有何作用？ 4、举例说明肽链有限水解修饰。
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称
为酶分子修饰（enzyme molecular modification）。 酶分子修饰的意义 提高酶的活力 增强酶的稳定性
降低或消除酶的抗原性 改变酶的底物专一性
研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空
间构象的影响。
把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法
称为金属离子臵换修饰。
有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的
发挥有重要作用。 1、酶的分离纯化
2、除去原有的金属离子 3、加入臵换离子
金属离子臵换修饰的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响 2、提高酶的催化效率 3、增强酶的稳定性
4、改变酶的动力学特性
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而
改变酶的催化特性的方法称为大分子结合修饰。大分子结合修饰是目前应用 最广泛的酶分子修饰方法 大分子结合修饰的作用 1、提高酶的催化效率
2、增强酶的稳定性，延长了酶在体内的半衰期 3、降低或消除酶蛋白的抗原性
1. 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 2. 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
3. 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，
肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。 1）提高酶活力 胃蛋白酶原的激活
胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 2）消除抗原性
一般大分子的外源蛋白抗原性较强，经肽链有限水解，降低分子量，抗原性显著降
低，甚至消失。
木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去了2/3肽链，酶活性不变，抗原性
大大降低。
七1、简述酶非水相催化的概念与特点。2、什么是必需水和水活度？水对非水相中
酶催化有何影响？ 3、有机溶剂对酶催化有何影响？
酶在非水介质中的催化反应具有的新特征：①可进行水不溶或水溶性差化合物的催
化转化，大大拓展了酶催化作用的底物和生成产物的范围；
②改变了催化反应的平衡点，使在水溶液中不能或很难发生的反应向期望的方向进行，如在水溶液中催化水解反应的酶在非水介质中可有效催化合成反应；
③使酶对底物的专一性提高，使对酶催化作用的选择性的有目的的调控的实现成为可能；
④大大提高了一些酶的热稳定性；
⑤由于酶不溶于大多数的有机溶剂，使催化后酶易于回收和重复利用； ⑥可有效减少或防止由水引起的副反应的产生；
⑦可避免在水溶液中进行长期反应时微生物引起的污染； ⑧可方便地利用对水分敏感的底物进行相关的反应；
⑨当使用挥发性溶剂作为介质时，可使反应后的分离过程能耗降低. 水对有机介质中酶催化的影响
酶溶于水，有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、
酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和产物的溶解度有关。
有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水含量。
维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。 必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的，氢键和盐键是酶空间结构
的主要稳定因素。
在非水介质中，只有在最适水含量时，蛋白质结构的动力学刚性与热力学稳定性之
间才能达到最佳平衡点，酶才表现出最大活性。
实验表明，水合作用能促进酶反应，而过量的水会导致酶活性下降。 a．不同酶需水量不同。
同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同。
在亲水性的溶剂中获得相同催化活力所需的水含量比在疏水性溶剂中要高。 酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。这种结构和构
象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”，而又有“柔性” 的状态。
“紧密”状态主要取决于蛋白质分子内的氢键。溶液中水分子与蛋白质分子之间所
形成的氢键使蛋白质分子内氢键受到一定程度的破坏，蛋白质结构变得松散，呈一种“开启” 状态。
在有机介质中水的存在状态分游离态（游离水）和结合态（结合水），水活度即表
示了这两种状态的存在比例。 水活度（water activity，Aw）：在一定的温度和压力下，反应体系中水的蒸气压
与同样状态下纯水蒸气压之比。 Aw＝P /P0 在一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加。而最佳水活度与溶剂的极
性大小没有关系。
该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。 有机溶剂对酶催化反应的影响
1、有机溶剂对酶结构与功能的影响
酶分子与溶剂直接接触，有机溶剂能 “剥去”维持酶催化所必需的水，破坏氢键，
降低分子表面张力，促使蛋白质去折叠而变性。
应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过修饰提高酶分子的亲
水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。 2、有机溶剂对酶活性的影响
有机溶剂选择要适当，其主要是通过对体系中水、酶及底物和产物的作用直接或间
接地影响到酶活性。
酶在低极性溶剂中具有较高的活性和稳定性。有机溶剂极性的强弱可以用极性系数
lgP表示 P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大，表明其极性越小；反之极性系数越小，则极性越强。 3、有机溶剂对底物和产物分配的影响
有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响
酶的催化反应。
有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度，而底物必须渗入必需水层，
产物必须移出此水层，才能使反应进行下去。
极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。
八1、何谓酶定向进化？有何特点？ 2、何谓易错PCR技术？什么叫做DNA重排技
术？什么是基因家族重排技术？ 3、突变基因的高通量筛选技术主要有哪些？各有何特点？
定向进化（directed evolution）是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并
在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需方向发展的技术过程。 定向进化的特点 一 、适合范围广
不同于合理设计 二 、目的性强
进化方向明确，具有很强的目的性。
如：针对某种酶的热稳定性差的弱点进行的定向进化。 三 、效果显著
短时间完成酶在自然界中几千年进化历程，且进化方向符合人类社会需求。 易错PCR是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使
扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。
DNA重排技术又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，
用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
基因家族重排技术该重排技术和DNA重排技术大致相同。区别在于基因家族重排所
用同源基因重排，而后者使用重同一基因易错 PCR获得的点突变进行重排。同源性高，获得杂合体几率低是对基因重排技术的改进，大大加速了基因体外进化的速度。 九1、试述酶反应器的主要类型和特点。2、选择酶反应器的主要依据有哪些？ 3、
如何控制酶反应器的操作条件？ 4、在酶反应器的操作过程中要注意哪些问题？ 反应器类型 搅拌罐式 反应器 适用的操作方式 分批式, 流加分批式 连续式 适用的酶 游离酶 固定化酶 特点 由反应罐，搅拌器和保温装臵组成。设备简单，操作容易，酶与底物混合较均匀，传质阻力较小， 反应比较完全，反应条件容易调节控制。 填充床反应器 连续式 固定化酶 设备简单，操作方便，单位体积反应床的固定化酶 密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。 流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。 鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。 膜反应器结构紧骤，集反应与 分离于一体,利于连续化生产, 但是容易发生浓差极化而引起膜孔阻塞， 清洗比较困难 通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的反应 流化床反应器 分批式 流加分批式 连续式 分批式 流加分批式 连续式 固定化酶 鼓泡式反应器 游离酶 固定化酶 游离酶 固定化酶 游离酶 膜反应器 连续式 喷射式反应器
连续式 一、根据酶的应用形式选择反应器 （一）游离酶反应器的选择
搅拌罐式反应器最常用有气体参与的酶催化反应，通常采用
鼓泡式反应器价格较高的酶，为了能够回收，可采用游离酶膜反应器 耐高温的酶，可采用喷射式反应器 （二）固定化酶反应器的选择
根据固定化酶的形状、颗粒大小和稳定性的不同进行选择。
固定化酶的形状主要有颗粒状、平板状、直管状、螺旋管状等，由于比表面积最大，最常用颗粒状固定化酶。
颗粒状的固定化酶可以选用搅拌罐式反应器、填充床式反应器、流化床反应器和鼓泡式反应器等进行催化。
搅拌罐式反应器不适用于机械强度较差的固定化酶。 采用填充床式反应器时应注意控制好反应器的高度。
采用流化床反应器时，固定化酶的颗粒不能太大，密度要与反应液的密度相当，而且要有较高的强度。
有气体参与的酶催化反应，通常采用鼓泡式反应器。
平板状、直管状、螺旋管状固定化酶一般采用膜反应器。 二、根据酶反应动力学性质选择反应器 主要影响因素： 酶与底物的混合程度
底物浓度对酶反应速度的影响 反应产物对酶的反馈抑制作用 酶催化作用的温度条件 （1）酶与底物的混合程度
搅拌罐式反应器、流化床反应器 均具有较好的混合效果
填充床式反应器混合效果较差
采用膜反应器时，可以采用辅助搅拌或其它方法来提高混合效果 （2） 底物浓度对酶反应速度的影响 高浓度底物抑制作用
具有高浓度底物抑制作用的游离酶，可以采用游离酶膜反应器进行催化反应。 具有高浓度底物抑制作用的固定化酶，可以采用连续搅拌罐反应器、填充床式反应器、流化床式反应器、膜反应器等进行连续催化反应，但需要控制底物浓度在一定的范围。
（3） 反应产物对酶的反馈抑制作用 最好选择膜反应器
对于固定化酶，也可以采用填充床式反应器 （4）酶催化作用的温度条件
对可以耐受100℃以上高温的酶催化反应，最好是选择喷射式反应器。 三、根据底物或产物的理化性质选择反应器
主要影响因素：1底物和产物的理化性质2分子量3溶解性4黏度 底物或产物的分子量较大，一般不采用膜反应器。
底物或者产物的溶解度较低、黏度较高应当选择搅拌罐式反应器或者流化床反应器，而不采用填充床式反应器和膜反应器。 有气体底物参与时，通常选用鼓泡式反应器。
需要小分子物质作为辅酶参与，通常不采用膜反应器。 四、其他影响因素
满足酶催化反应所需的各种条件
结构简单、操作简便、易于维护和清洗。 具有较低的制造成本和运行成本。 一、酶反应器操作条件的确定及其调控 1、反应温度的确定与调节控制
根据酶的动力学特性，确定酶催化反应的最适温度。
将反应温度控制在适宜温度范围内，在温度发生变化时，及时进行调节。 夹套、列管等换热装臵。
喷射式反应器，通过控制水蒸汽的压力。 2、pH值的确定与调节控制
根据酶的动力学特性，确定酶催化反应的最适pH。
分批式反应器，通常在加入酶液之前，用稀酸或稀碱调节底物溶液到酶的最适pH。 连续式反应器，一般将调节好pH的底物溶液连续加到反应器中。
有些酶的底物或产物是一种酸或碱，反应前后pH变化大，必须在反应过程中进行必要的调节。
3、底物浓度的确定与调节控制
底物浓度是决定酶催化速度的主要因素之一。 要确定一个适宜的底物浓度范围。 通常底物浓度在5~10Km。
要防止高浓度底物的抑制作用。 4、酶浓度的确定与调节控制
综合考虑反应速度和成本，确定一个适宜的酶浓度。
对连续式固定化酶反应器应具备添加或更换酶的装臵，而且要求这些装臵的结构简
单、操作容易。
5、搅拌速度的确定与调节控制
首先要在试验的基础上确定适宜的搅拌速度，并根据情况的变化进行搅拌速度的调
节。
搅拌速度过慢，会影响混合的均匀性；
搅拌过快，产生的剪切力会使酶的结构受到影响，尤其是会使固定化酶的结构破坏
甚至破碎。
6、流动速度的确定与调节控制
必须确定适宜的流动速度和流动状态（流体速度、流量、进液管的方向和排布等），
并根据变化的情况进行适当的调节。
流化床反应器，通过控制进液口的流体流速和流量以及进液管的方向和排布等方
法，加以调节。
填充床式反应器，必须选择好适宜流速。
膜反应器，采用适当的速度搅拌，使粘附在膜表面的固形物和大分子物质离开膜表
面，还可以通过控制流动速度和流动状态，使反应液混合均匀，减少浓差极化现象的发生。
喷射式反应器，可以控制蒸汽压力和喷射速度进行调节。 二、酶反应器操作的注意事项 1、保持酶反应器的操作稳定性
在酶反应器的应用过程中，尽量保持操作的稳定性，以避免反应条件的剧烈波动。 搅拌罐式反应器，尽量保持搅拌速度的稳定；连续式反应器，尽量保持流速的稳定，
流进的底物浓度和流出的产物浓度不要变化太大；填充床式反应器，防止固定化酶的破碎、挤压而产生的阻塞现象发生。膜反应器，要防止浓差极化而产生的膜孔阻塞现象。反应过程，尽量保持反应温度、反应液pH值等的稳定，不要波动太大，以保持反应器恒定的生产能力。 2、防止酶的变性失活
特别注意防止酶的变性失活。影响因素主要有温度、pH、重金属离子以及剪切力等。
通常在等于或者低于酶催化最适温度的条件下进行； pH控制在酶适宜的范围内；重金属离子的影响；剪切力是引起酶变性失活的一个重要因素。 3、防止微生物的污染
在应用酶反应器进行催化反应过程中，由于酶的作用底物或反应产物往往只有一二
种，一般情况下不具备微生物生长、繁殖的基本条件，在进行操作时，一般不必在严格的无菌条件下进行操作，然而并不意味着不必防止微生物污染。不同酶的催化反应，由于底物、产物和催化条件各不相同，在催化过程中受到微生物污染的可能性有很大差别一些酶催化的底物或产物对微生物的生长、繁殖有抑制作用，受微生物污染的情况较少有些酶催化反应温度较高，微生物无法生长有些酶催化反应的pH较高或较低，对微生物有抑制作用。有些酶可以在有机介质中进行催化反应，污染的可能性甚微。而有些酶催化反应的底物或产物是微生物生长、繁殖的营养物质，在反应过程中或者在反应结束后，在适合微生物生长繁殖的条件下，必须注意防止微生物的污染。酶反应器的操作必须符合必要的卫生条件，尤其是在生产药用或食用产品时，卫生条件要求较高，应尽量避免微生物的污染。 十1、举例说明酶在医药方面的应用。
2、举例说明酶在食品方面的应用。酶在医药方面的应用可归纳为三个方面： 疾病诊断
疾病的预防和治疗 制造各种药物
酶在食品方面的应用 酶在食品保鲜方面的应用 酶在食品生产方面的应用
酶在食品添加剂生产方面的应用 改善食品的品质和风味
一、单项选择题（10分）二、填空题（20分）三、判断题（10分）四、名词解释（15分）五、英翻中（5分）六、简答题（30）七、综合题（10）
抗体酶是具有酶催化功能的抗体分子，本质为免疫球蛋白，但在可变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体（Catalytic antibody） 。 （一）模拟酶的概念
又称人工酶或酶模型，就是研究天然酶中那些起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些比天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子。这些物质分子可以模拟酶对底物的结合和催化过程，既可以达到酶催化的高效率，又可以克服酶的不稳定性，这样的物质分子称为模拟酶。
就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。
表面活性剂分子在水溶液中超过一定浓度可聚集成胶束。胶束在水溶液中提供了疏水微环境 ，类似于酶结合部位，可以对底物进行束缚。若再将一些催化基团如：咪唑、硫醇、羟基和一些辅酶共价或非共价地连接或吸附在胶束上 ，就有可能提供酶的“活性中心”部位，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酶。 半合成酶它是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的 “人工酶”。
核酶（Ribozyme）主要指一类具有生物催化功能的RNA，亦称RNA催化剂。
核酶可通过碱基配对特异性地与相应的RNA底物结合。在特定的位点切割底物RNA分子，是一类很有希望的基因功能阻断剂，被形象地称为“分子剪刀”。 极端微生物是生活在地球上最极端环境条件下的有机生命，又称嗜极菌。 极端酶是指那些可在非常规条件下作用的酶。
抗体酶是具有酶催化功能的抗体分子，本质为免疫球蛋白，但在可变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体（Catalytic antibody） 。
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