花色苷纯化分离及鉴定研究进展.

基金项目 :国家自然科学基金 (31271836 ; 湖南省研究生创新课题(CX2012B290 作者简介 :魏一枝 (1990－ , 女 , 硕士 , 研究方向为农产品加工及贮藏工程。通信作者 :

邓洁红 (1967－ , 女 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向为园艺产品深加工理论与技术 , 通信地址 :410128湖南长沙市芙蓉区湖南

农业大学食品科技学院

, E-mail :hongjiedeng@163．com 。花色苷纯化分离及鉴定研究进展魏一枝 1, 邓洁红 1, 2, 王维茜 1, 刘永红3

(1．湖南农业大学食品科技学院 , 长沙 410128; 2．食品科学与生物技术湖南省重点实验室 ,

长沙 410128; 3．湖南生物机电职业技术学院 , 长沙 410127

摘要 :花色苷是高等植物中最重要的水溶性色素。因其种类繁多、来源广泛、安全无毒并有一定的

营养和保健功效而引起国内外的广泛关注 , 具有十分重要的开发价值和广阔的应用前景。文中介绍了国内外花色苷分离纯化 (层析法、高速逆流色谱、膜分离法、固相萃取、以及花色苷鉴定 (高效液相色谱 -串联质谱法 , 核磁共振法的研究方法 , 并对各种方法进行了分析评价。对全面认识和开发利用花色苷具有一定的参考价值。

关键词 :花色苷 ; 纯化 ; 分离 ; 鉴定

中图分类号 :TS264．4文献标志码 :A 文章编号 :1005－1295(2014 01－0050－05doi :10．3969/j．issn．1005－1295．2014．01．013

Ｒesearchon Isolation and Identification of Anthocyanins WEI Yi-zhi 1, DENG Jie-hong 1, 2 , WANG Wei-qian 1, LIU Yong-hong 3

(1．College of Food Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha 410128, China ; 2．Key

Laboratory of Food Science and Biological Technology of Hunan Province , Changsha 410128, China ;

3．Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic , Changsha 410127, China Abstract :Anthocyanins are the most important water-soluble pigment in plants．It caused widespread concern at home and abroad because of its variety and wide range of sources , safety and rich in nutrition and health effects , it has a very important

development value and broad application prospects．The present paper mentioned some methods for anthocyanin separation and purification (chromatography , high-speed countercur-rent chromatography , membrane separation , solid phase extraction , and identification (high performance liq-uid chromatography-tandem mass spectrometry , nuclear magnetic resonance spectroscopy ．

Key words :anthocyanin ; purification ; separation ; identification 0引言

随着人们对食品安全意识的提高

, 开发和应

用天然色素已成为食品色素行业的发展趋势。花色苷是一种重要的水溶性色

素 , 花色苷的定性与定量、生理活性与功能、高效提取与绿色分离技术

以及结构稳定性一直是研究的重点

。花色苷的提

取技术已经发展得比较成熟 , 国外多采用盐酸化甲醇、丙酮、硫酸、乙酸或盐酸水溶液提取 [1－3] , 国

内多采用柠檬酸、盐酸水溶液和酸化乙醇作为提取剂 , 如今超声波和微波技术也用来辅助溶剂提

取。随着技术的发展 , 超临

界、高压脉冲电场、酶法提取 , 及亚临界萃取技术也被应用于花色苷提

5包装与食品机械 2014年第 32卷第 1期

取。但如何更好地纯化、分离 , 以获得价格低廉、高纯度而且性质稳定的花色苷是研究的目标。由于花色苷应用、产品研发工业化需求的增加 , 过去的纯化分离方法已经不能满足市场的需求究进行综述。

1花色苷纯化分离

一般来说 , 经过提取后的花色苷粗品中往往

含有很多有机酸、糖等杂质 , 产

。因此本文将对纯化分离及鉴定的技术研

品质量稳定性差、纯度不高。为了提高产品的色价和稳定性 , 需要对提取物进一步纯化。纸色谱、薄板色谱和柱色谱是较传统的分离方法

。近年学者们利用高

效液相色谱法 , 以及高速逆流色谱、膜分离法、反相高效液相色谱对花色苷成功地进行了纯化。

1．1层析法

层析法是应用最广泛的一类纯化技术。根据固定相的不同 , 柱层析分离的原

理有所不同。目前大多采用凝胶、聚酰胺、硅胶、离子交换树脂、大孔树脂等。但聚酰胺层析在花色苷中应用不多

1．1．1大孔树脂层析

在国内外分离纯化物质的若干方法中

, 利用大孔吸附树脂纯化天然植物色素是 , 主要用于黄酮类化合物的分离纯化

。

一种适合工业化生产的方法 , 该方法工艺简单 , 可不用或少用除乙醇之外的有机溶剂 , 安全性强 , 树脂再生容易 , 重复利用率高。国内外研究者应用大孔吸附树脂多种植物色素进行了纯化

。目前天然产物化学成分分离中最常用的树脂有三菱公

对

司的 HP 系列、以及美国Ｒohn＆hass 公司生产的 Amberlite XAD 系列。邓洁红在刺葡萄皮花色苷的研究中

用了 8种大孔吸附树脂发现 HP-20树脂在纯化刺葡萄

皮色素中 , 表现出良好的吸附性及洗脱性 , 优于其他几种树脂 [4]。 HP-20树脂静态吸附最优条件 pH 值为 3、温度40? 、其静态饱和吸附量达到 32．0796mg /g湿树脂 (色素原液浓度 1．2357mg / mL 。其解吸率可达到 92%以上 , 树脂动态饱和吸附量达到 39．00mg /mL湿树脂 , 色素液纯化后色价为原来的 5．93倍。 J．Chandrasekhar 等在分离紫甘蓝中的花色苷时 , 基于洗脱剂液体的体积 , 解吸液体积及其中溶质的浓度做出了 XAD-7的动态的吸附曲线和解吸曲线 [5], 吸附的最佳工艺参数如下 :在样品溶液中的花色素苷的浓度为

0．21mg /mL, 加工量为 5．3BV ,

流速为 2mL /min, 温度为 25?2? 。解吸工艺的最佳参数 :洗脱液的体积和流速为3BV (100%, v /v 乙醇和 2mL / min 。为了检查最终产品 (花色素苷的稳定性 , 观察到纯化后糖的浓度 , 从初始 224．7g /mL降低至 0．07g /mL。色度值从 34．05增加至 46．67。表明花青素纯化后的稳定性增加

。 XAD-7HP 显示最高吸附容量

达 0．84mg /mL, 回收率 92．85%。李杨等人以烟 73酿酒葡萄为花色苷提取材料 , 采用 HPLC 分析方法 , 对 10种树脂的吸附 /解析效果进行了比较 [6]。选定结果较优的 XAD-7HP 树脂进行纯化试验。花色苷的干物质中含量由处理

前的 48．16%

提高到处理后的 94．93%, 色价由处理前的 47．7提高到处理后的 291．6, 回收率为 85．7%。在避光、 pH 值为3, 4? 的条件下存放 7天 , 花色苷的保留率在 95%以上 , 适宜于花色苷的短期保存。

1．1．2聚酰胺层析法

刘敬华等在蓝靛果花色苷分离纯化研究中以

X-5纯化后的蓝靛果花色苷为原

素试验 , 在此基础

料 [7], 以聚酰胺作为层析介质 , 以纯度和回收率为指标进行单因

上应用响应面分析法 , 获得层析的最佳条件为 :上样浓度为 3．0mg /mL, 上样体积为 25mL , 径长比为 1? 15, 洗脱剂乙醇的浓度为 60%, 洗脱剂的流速为 2mL /min, 在此条件下纯化的花色苷的纯度达到 34．85%, 常规法用大孔树脂纯化的蓝靛果花色苷纯度大概在 14% 18%, 这样纯化的蓝靛果花色苷较大孔树脂纯化的花色提高 1倍左右 , 是未纯化的蓝靛果花色苷

1．1．3凝胶柱层析法

凝胶层析也称排阻层析 , 工作原理是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用根据被分离物质的分子大小不同来进行分离

,

粗提物的 14倍左右。

苷纯度

。朱振宝等人初步研究了紫甘蓝花色

苷在 Sephadex LH-20凝胶层析柱上最佳的分离条件 [8], 当以 30%乙醇为洗脱液 , 流速为 1mL /min时 , 紫甘蓝花色苷的分离效

果最好。凝胶柱层析的优点是操作条

件比较温和 , 可在相当广的温度范围内进行 , 不需要有机溶剂 , 并且对分离成分理化性质的保持有独到之处 , 但吸附力弱。刘亮等人采用柱层析法对荔枝果皮要的花色苷及低聚黄烷醇分离纯化时

中主

[9], 分别采用 Amberlite XAD-16、 ADS-17

荔枝花色苷及低聚

大孔树脂和 Toyopearl TSKHW-40S 柱层析相结合的方法纯化黄烷醇类化合物 , 分离纯化得 15

到 1种花色苷和 4种低聚黄烷醇化舍物单体 , 利用 HPLC-MS 、 GC 、 NMＲ及 CD 等分析手段进行结构分析表明 , 纯化得到的花色苷为荔枝中主要的

花色苷

矢车菊素 -3-芸香糖苷 , 以及 4种低聚黄烷醇化合物。试验证实大孔树脂与Toyopearl TSKHW-40S 凝胶柱层析相结合 , 可有效分离纯化荔枝中花色苷及低聚黄烷醇类化合物。同样 , 在其他天然产物的纯化分离中 , 研究者们也可利用结合层析的方法以得到更好的效果

1．1．4离子交换树脂层析

。

目前在国内 , 离子交换树脂主要用于脂溶性化合物的纯化 , 管娜娜等在γ-氨基

丁酸 (GABA 的富集中采用 0．02mol /L, pH5．6的 Na 2HPO 4-柠檬酸缓冲液进行富集后 , 采用 D001大孔强酸性阳离子交换树脂对该富集液进行纯化试验

[10], 调

节富集液 pH2．0, 以 2mg /mL的浓度上样吸附 , 2mol /L的氨水浓度进行洗脱 , 最终得到纯度为 61．25%γ-氨基丁酸。邢庆超 D-阿洛酮糖的分离纯化中采用001? 7型阴阳离子交换树脂脱色脱

盐 , 再通过 DTF-Ca 2+型离子交换树脂进行分离纯

化

[11]。得到最佳分离条件为柱温60? , 10mL 进样量 , 1mL /min流速。通过高效液

相色谱测定 , 分离得到 D-阿洛酮糖纯度为 98．3%。在工业应用中 , 离子交换树脂的主要优点是处理能力大 , 脱色范围广 , 脱色容量高 , 能除去各种不同的离子 , 可以反复再生使用 , 工作寿命长 , 运行费用较低 (虽然一次投入费用较大。笔者认为利用夹带剂或者其他方法 , 也可以使离子交换树脂在花色苷的好的作用。

1．2高速逆流色谱 (HSCCC

易建华利用 HSCCC 色谱法 , 采用正丁醇 -甲基叔丁基醚 -乙腈 -水 -三氟乙酸(2?2? 1? 5? 0．01, V / V /V/V 为溶剂系统 , 流速为 2mL /min, 主机转速设定为 800r /min, 紫外检测波长为 254nm , 并从紫甘蓝花色苷中分离得到得到 3种化合物[12]。经 HPLC 检测 , 纯度分别为 76．28%, 45．46%, 91．46%。李佳银等在试验中以新鲜紫锥菊花瓣

为原料 , 用含 0．1%HCl 的 60%乙醇为溶剂避光冷浸提取 ,

提取中发挥很

经乙酸乙酯萃取和 D101大孔吸附树脂(100mL , 2cm ? 30cm 纯化后 , 得 2．1g 紫锥菊花色苷提取物干粉样品 [13]。以水 -正丁醇 -甲基叔丁基甲醚 -乙腈 -三氟乙酸(6? 3? 2? 1? 0．001 为 HSCCC 分离溶剂系统 , 上相为固定相 , 下相为流动相 , 流速2．0mL /min, 进样量 160mg , 通过一次分离得到 2种花色苷单体化合物 , 经 HPLC 检测其纯度分别达 95．1%(9．8mg 、 98．2%(14．3 mg 。与传统的层析法相比 , 它具有高效、快速、操作简单、回收率高、制备量大等的优点 , 已经被广泛应用于天然产物的分离纯化和食品原料的开

1．3膜分离法

发利用等领域。

膜分离技术是使用具有选择透过性的膜为分离介质 , 当膜两侧存在某种推动力

通过或被截留 ,

(如压力差、浓度差、电位差等时 , 物料依据滤膜孔径的大小而

选择性地透过膜 , 达到分离、提纯的目的。花色苷提取中常用的膜分离技术有超滤 (UF 、反渗透 (ＲO 、电渗析 (ED 等。 Patil 用溶剂提取提取红萝卜花色苷后用膜分离法有效脱醇并富集了花色苷 , 使花色苷含量从 372．6mg /L提高到 625．8mg /L[14]。之后在常温常压下采用渗

透膜蒸馏的方法将其进一步浓缩至

4850mg

/L。张亚红等采用 D101大孔树脂和 6000道尔顿分子量的超滤膜纯化技术对野生蓝莓花青素纯化后纯度可达 35%以上 [15]。试验中采用不同截留相对分子量的膜 , 不同规格超滤膜分离工艺 , 结果 6000道尔顿的膜产品得率高达 96．6%。万莹在紫薯花色苷的提纯工艺中分别对比砂芯过滤

、微滤、超滤对紫薯花色苷色

素粗提液纯化的影响 [16]。确定了微滤－超滤联用的色素纯化工艺 , 且比对了纳滤与反渗透对超滤滤液的浓缩效果

。膜分离纯化的花色苷色价和透明度高

,

稳定性好 , 容易实现连续化生产 , 生产过程劳动强度低 , 流程简单 , 但对设备要求高 , 纯化成本高 , 提取效率低。 1．4固相萃取

固相萃取 (Solid Phase Extraction SPE 就是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理。这种方法曾突破性地应用在油脂中萃取胆固用 SPE 使萃取纯化和结合态胆固

醇 , 吴钟玲等利

骤

醇的水解同时进行 , 大大简化了试验的操作步

[17]。 L．C．Kerio 等在研究肯尼亚茶花青素的提取和鉴定中 , 用 18C 固相萃取

(SUPELCO , SPE 美国 Sigma-Aldrich 公司 , 经 HPLC 法检测 , 绿茶中花色苷浓度从 198ug /mL上升至 1193．4ug /mL, 而红茶中的花色苷浓度由 124．5ug /mL上升至 590ug /mL[18]。陈亮等人在利用固相萃取时 , 采用 Zorbax SB －18C 色谱柱(250mm ? 4．6mm , 5μm , 以甲醇－5%甲酸水溶液为流动相纯化野苷 [19]。与液－液萃取相比固相

25

萃取有很多优点 :固相萃取不需要大量互不相溶

的溶剂 , 处理过程中不会产生

生桑葚中的花色

乳化现象 , 它采用高选择性的吸附剂 (固定相 , 能显著减少溶剂的用量 , 简化样品

于处理过程 , 同时所需费用也有所减少。一般说来固相萃取所需时间为液－液萃

取的 1/2, 费用为液－液萃取的 1/5, 有利于这种方法的工业化。

2鉴定

现已发现的花色苷有 500多种 , 而且每年不断有新的花色苷被发现。花色苷的鉴定已经由过去的光谱分析法发展到了液质联用及核磁共振

2．1高效液相色谱 -串联质谱法

高效液相色谱 -串联质谱法 (HPLC-MS 是目前花色苷鉴定中应用最为广泛的分析方法。陈亮等人在利用固相萃取纯化野生桑葚的花色苷后谱 -电喷雾质谱联用技术鉴定了

, 再用高效液相色法。

桑葚中 3种花色苷并得到其相对含量 [20]。舒希

0．1%盐酸的甲醇溶液提取芍药中的花色苷

,

凯等人在鉴定芍药花色苷时首先用含

经 XDA-7大孔树脂纯化后 , 用高效液相色谱 -电喷雾串联质谱进行紫外 -可见光谱和质谱分析鉴定出 4种花色苷。杨智勇等人采用超高效液相 -三重四极杆串联质谱法对我国紫色马铃薯品种

“　黑金刚”　中花青苷进行组分和含量分析 , 鉴定出其中

少标准品的缺陷 ,

主要含有 7种花色苷 [21]。液质联用技术不仅克服了色谱法缺大大提高了花色苷鉴定的准确鉴定也具有独特的优势

。

性 , 对高沸点、难挥发和热不稳定化合物的分离和

2．2核磁共振法 (NMＲ

E．Ferrari 等利用 NMＲ对红葡萄酒中的花色

苷进行了鉴定 [22]。舒希凯采用

聚酰胺柱层析、 C18柱色谱、高效制备液相色谱、高速逆流色谱等方法对芍药花分离得到 16个化合物 [23], 经过质谱、 1H-NMＲ和 13C-NMＲ并和参考文献对比 , 鉴定出 16种化合物中的 8种化合物是首次从在该种

植物分出。闫倩倩利

色

用 LC-MS 、 1H-NMＲ和 13C-NMＲ波谱分析 [24], 鉴定出在以往的报道中以花苷结合的方式存在于紫甘薯中为咖啡酰类物

质 , 包括咖啡酰基奎宁酸和咖啡酰基二

糖苷二类 , 5-咖啡酰基奎宁酸、 3, 5-二咖啡酰基奎宁酸和 4, 5-二咖啡酰基奎宁酸 , 而咖啡酰基 -β-D-呋喃果糖基 -α-D-吡喃葡萄苷和反式 4, 5-二咖啡酰基奎宁酸在紫

甘薯的块根中还是首次发现。研究证明此方法具有极高的选择性 , 且制样方便 ,

测定快速 , 重现性好。目前低分辨率 NMＲ法已成为食品工业应用较为广泛的技术。

3结束语

有关花色苷的纯化分离方法已日渐成熟

, 逐渐由层析技术 (包括柱层析 , 聚酰

胺层析 , 硅胶层析 , 离子交换树脂层析 , 大孔树脂层析向膜分离等高新技术转变 , 而花色苷的鉴定逐渐由过去单高提取纯化过程中花色苷稳定性

一的色谱法向联用技术转变

。这些技术不仅能够提

, 而且其快速高效精准的特点 , 为研究者节约了时

, 合成色素的使用越来

性 ,

间及成本。另外 , 随着人们对食品安全问题关注度的提高

越受到限制 , 天然色素的优越性日趋明显。天然色素较高的使用安全性和功能具有更加广泛的发展空间和前景

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(上接第 37页

(2 高容量电容器低压充放电可以获得较高

的单次脉冲能量和脉冲磁场峰值强

、纯化与特性 [D ]． [D ]．济南 :山东师范大学 ,

度 ; 当充电电压为 400V 时 , 脉冲磁场的峰值强度可以达到 4T 左右 ;

(3 电容限流的充电方式可以提高脉冲电源的充电效率 , 可编程控制技术可以

实现脉冲磁场的自动充放电。

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