中国人兽共患病学报 ２０１１，２７（１１） Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ９８３ 文章编号：１００２—２６９４（２０１１）１１—０９８３—０４ 江苏省肠出血性大肠埃希菌０１５７ 的基因ＰＣＲ—ＲＦＬＰ分型研究＊ 钱慧敏 ，朱叶飞 ，董晨 ，张平平。，朱凤才 摘 要：目的 对历年从江苏省不同地区分离的肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７（以下简称：Ｏ１５７）进行分型分析。方法 采 用多聚酶链反应一限制性片段长度多态性分析（ＰＣＲ－ＲＦＩ Ｐ）方法对１０８株０１５７分子分型，比较不同地区、不同年份菌型差异。 结果 根据Ｅｃ０ＲＶ限制性酶切图谱可将菌株分成ＪＳ０１一ＪＳｌＯ十个不同的型别。主要菌型ＪＳ０１占６４．９ ，ＪＳ０２型与ＪＳＯｌ型 菌株酶切图谱相似度很高，ＪＳ０３和ＪＳ０４型菌株数目较少（１２株），但近一半属于人源菌株。从时间方面看，１９９９年分离的菌 型最多；从地区方面看，铜山县分离到的菌株型别最为多样化。结论 不同茵型之间的致病性存在差异，菌株与地理来源的 关系密切。ＰＣＲ—ＲＦＩ Ｐ方法操作简便、重复性好，为Ｏ１５７的流行病学研究提供了一条全新途径。 关键词：大肠埃希菌０１５７；限制性酶切；ＰＣＲ—ＲＦＩ Ｐ；分子分型 中图分类号：Ｒ３７８．２ 文献标识码：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗｉｔｈ ＰＣＲ—ＲＦＬＰ ＱＩＡＮ Ｈｕｉ—ｍｉｎ ，ＺＨＵ Ｙｅ—ｆｅｉ ，ＤＯＮＧ Ｃｈｅｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｐｉｎｇ—ｐｉｎｇ。，ＺＨＵ Ｆｅｎｇ—ｃａｉ （Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１ ５ ７ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｒａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｊ ｉａｎｇｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｙｅａｒｓ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ—ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＰＣＲ—ＲＦＩ Ｐ）ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｏｎｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｅｉｇｈｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１ ５ ７ ｓｔｒａｉｎｓ，ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｙｅａｒｓ． ＥｃｏＲＶ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｅｎ ｔｙｐｅｓ ｎａｍｅｄ ＪＳＯ１－ＪＳ１０．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ６４．９ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ＪＳ０１，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ＪＳ０２ ｉｎ ｄｉｇｅｓｔ ｐａｔｔｅｒｎ．Ａｌｍｏｓｔ ｈａｌｆ ｏｆ １２ ｓｔｒａｉｎｓ ｎａｍｅｄ ＪＳ０３ ａｎｄ ＪＳＯ４ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕ— ｍａｎ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ＥｃｏＲＶ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ １９９９，ｗｈｅｒｅａｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｔｏｎｇｓｈａｎ ｈａｄ ｇｒｅａｔ ｖａｒｉｅｔｙ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｅｓｔｅｄ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｇｒｏｕｐｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｃｕｈｉｖａｒｓ ｏｒｉｇｉｎｓ，ｗｈｉｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ，ｉｔ ｉｓ ｅｖｉｄｅｎｔ ｔｈａｔ ＰＣＲ ＲＦＩ Ｐ ｉｓ ｅａｓｙ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ａ ｂｒａｎｄ—ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１５７；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ；ＰＣＲ—ＲＦＩ Ｐ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ 肠出血性大肠埃希菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓ— 在美国、Ｅｔ本、加拿大等发达国家均有Ｏ１５７感染的 ｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ，ＥＨＥＣ）Ｏ１５７是上世纪八十年代在美 相关报道＿３］，１９８６年江苏徐州地区首次检出Ｏ１５７ 国发现的１种具有高致病性和病死率的病原微生 ：Ｈ７以来＿４］，在国内江苏、浙江、安徽、海南Ｅｓ－８］等 物，牛、羊、猪等家畜是其主要宿主［１］。大肠埃希菌 省份也陆续有菌株检出。１９９９年淮北黄泛平原部 Ｏ１５７基因组中携带由噬菌体编码的志贺样毒素，感 分地区发生１起Ｏ１５７：Ｈ７暴发性流行，随后我省 染该菌后除出血性或非出血性腹泻外，严重者可导 在不同地区设立监测点，调查Ｏ１５７宿主动物带菌 致各种并发症，如溶血性尿毒性综合症（ＨｕＳ）、血 情况。为了从基因水平探索大肠埃希菌Ｏ１５７传播 栓性血小板减少性紫癜（ＴＴＰ）等 ］。近二十年来， 模式、探讨其致病多样性及地区分布差异的内在原 因，本文针对噬菌体中编码的特异性基因，利用 ＊８６３项目（Ｎｏ．２００７ＡＡ０２Ｚ４０９）资助 通讯作者：钱慧敏，Ｅｍａｉｌ：ｊｓｑｈｍ＠１２６．ｃｏｒｎ ＰＣＲ—ＲＦＩ Ｐ分子分型方法，对江苏省内１９９９—２００１ 作者单位：１．江苏省疾病预防控制中心，南京２１０００９ 年间从宿主动物和患者粪便中分离的暴发、散发菌 ２．东南大学公共卫生学院，南京 ２１０００９ 株进行了同源性分析，揭示了不同年代、不同地区、 ９８６ 中国人兽共患病学报 分为１０种不同菌型。由于实验选取位于噬菌体上 信号，提高对Ｏ１５７暴发的主动预防和处理能力，指 的毒力基因上游片段间差异，利用ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法 分类得到的菌型，由于序列差异可能在毒素表达、分 泌及菌株间转移存在差异，由此导致致病性强弱的 不同。３年中大部分环境来源的菌株属于同一型别 （ＪＳ０１），该型病人样本数也最多，说明这一型菌株致 病力较强，在宿主动物和人间易于传播，为江苏地区 主要流行株。ＪＳ０１型菌株在江苏省８个地区的广 泛分布，特别是Ｏ１５７暴发流行的铜山、丰县地区检 出率较高，表明周边地区菌株可能与暴发菌株属于 同一来源。ＪＳ０２型与ＪＳ０１型菌株酶切图谱相似度 超过８５ ，而ＪＳ０２型只在外环境中检出，提示两者 亲缘关系较近，后者致病性有所降低，遗传物质传递 过程可能发生了基因突变。外环境样本分离得到的 ＪＳ０３和ＪＳ０４型菌株数目较少（共１２株），其中５株 来源于病人标本，说明这两种型别致病性强。聚类 分析中，它们与外环境中大量携带的ＪＳ０１型菌株属 参 ］ ］ ］ Ｌ］ ！Ｊ ］ 于两个不同簇类，相关性较小。因此，在监测中尤其 要关注这两类菌型，其检出率的升高与否，一定程度 上为Ｏ１５７疫情预警提供了有力依据。某些型别零 星菌株的出现也说明江苏省大肠埃希菌Ｏ１５７的基 因图谱呈现多样性，在其毒力基因和致病性上需要 进一步研究。 从菌型的时间分布看，１９９９年分离菌株型别最 多，而其后两年菌型趋于单一化。从菌型的地区分 布看，铜山和丰县分离的菌株最多，菌型复杂，该地 区也是１９９９年江苏Ｏ１５７疫情暴发地点，应重点加 强对该地区的监测。 综上所述，不同菌型之间的致病性存在差异， 菌株与地理来源的关系密切。ＰＣＲ—ＲＦＩ Ｐ方法简 便易行，耗时少，可重复性高，分型图谱条带明确清 晰辨识度高。在运用其它分子技术无法解释编码相 同基因的病原菌间差异时，ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法为大肠 埃希菌０ｌ５７的分布和同源性分析提供了一条更加 有效的途径口 。依靠该技术总结Ｏ１５７的流行规律 和菌株亲缘关系，能够提供其感染暴发流行的预警 导Ｏ１５７疫苗研究。 ］ ］ ］ 口 Ｏ 口 ｌ 收稿日期：２０１１－０４—２１；修回日期：２０¨Ｏ６一ｌ５ ］