水涝胁迫下欧李SOD和POD的变化

邬晓勇;李潘;张敏;孙雁霞;苟小军

【摘 要】通过盆栽实验法,测定水涝条件欧李SOD和POD酶的活性的关系,考察SOD、POD抗氧化酶系统在欧李抗涝生理研究中的作用.采用邻苯三酚自氧化法对叶片中SOD的活性进行测定;采用愈创木酚法对叶片中POD酶活性进行测定.实验结果表明,欧李在水涝胁迫下,植物体内的SOD酶活性大量降低而POD酶适量地增加;一段时间后,SOD酶不降反增而POD酶活性降低;实验后期SOD酶和POD酶都同时呈现了下降趋势,最后趋于稳定.水涝虽会对欧李的生理状态产生一定影响,但结果表明欧李在短期水涝胁迫下有较强的适应能力. 【期刊名称】《成都大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2016(035)002 【总页数】5页(P130-133,139) 【关键词】欧李;水涝;POD;SOD;酶活性 【作 者】邬晓勇;李潘;张敏;孙雁霞;苟小军

【作者单位】成都大学药食同源植物资源开发重点实验室,四川成都610106;成都大学药学与生物工程学院,四川成都610106;成都大学药学与生物工程学院,四川成都610106;成都大学药学与生物工程学院,四川成都610106;成都大学药学与生物工程学院,四川成都610106;成都大学药食同源植物资源开发重点实验室,四川成都610106

【正文语种】中 文

【中图分类】S662.5

欧李为蔷薇科樱桃属欧李树种，是世界上最矮小的木本果树，广泛分布于我国的东北、华北、西北等地[1-2]，其钙的含量居所有水果之首[3-4]，具有较为广阔的开发利用前景[5].相关研究发现，在严重水分胁迫下，植物体内自由基大量产生，抗氧化功能明显降低[6-7].超氧化物歧化酶(SOD)，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O2·-)生成H2O2和O2，H2O2可由过氧化氢酶(CAT)催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害.目前，对欧李的研究主要集中在其栽培和矿质元素含量方面，而对于在水涝逆境下的欧李植物叶片酶的活性研究少有报道.本研究对从北方引种到南方的欧李在水涝胁迫下其植物叶片内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性进行测定与分析，了解欧李在南方温暖湿润的气候中的生长状况，为欧李的进一步开发利用提供基础数据.

实验植物材料为2008年秋季从山西引种到成都的欧李，2014年3月份选长势良好的移栽至花盆中，正常管理.实验设计为8株长势相同的欧李植物，随机分为2组：处理组和对照组.处理组的4株欧李采用双套盆法进行水涝胁迫的处理，对照组的为正常条件下正常管理.进行连续168 h的观测和定时采样测定.

实验试剂：0.2%愈创木酚、磷酸缓冲液、30%过氧化氢、考马斯亮蓝G-250、标准牛血清蛋白、邻苯三酚溶液、盐酸溶液、Tris-HCI缓冲液、100 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)或5%抗坏血酸(维生素C)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、石英砂等均为国产分析纯.

实验仪器：722型分光光度计，核酸蛋白检测仪(UV-2802PC)，高速冷冻离心机，秒表，FA2004B型电子天平，研钵，紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，试管，移液管，CT15RT型高速冷冻离心机，离心管，移液枪等.

SOD和POD酶的提取方法参照郝建军的方法[8]稍有改动：于每天上午10：30左右取样2～3 g植物叶片(取样部位为植物当年生枝条中部叶片)；实验设计为单

株小区，重复3次后取平均值；将所采叶片清洗称重后切碎.

1)SOD提取.将切碎叶片置于加有3 mL浓度为0.05 mmmol/L的Tris-Hcl的预冷的研钵中，加入适量石英砂于冰浴环境下研磨成匀浆，以13 000 r/min，4 ℃离心15 min收集上清液即为SOD酶液， 取上清液用Tris-Hcl缓冲液定容至5 mL试管中，保存在冰箱中备用.

2)POD提取.将切碎叶片置于加有3 mL浓度为20 mmol/L的KH2PO4的预冷的研钵中，再加入适量石英砂于冰浴环境下研磨成匀浆，以10 000 r/min，4 ℃离心10 min收集上清液即为POD酶液，取上清液用磷酸缓冲液定容至5 mL试管中，保存在冰箱中备用. 1)SOD酶活性的测定方法.

邻苯三酚自氧化速率的测定[9]：取pH值为8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5mL于10 mL比色管中，于25 ℃恒温10 min，再加入25 ℃恒温的45 mmol/L的邻苯三酚溶液10 uL，混匀后迅速于1 cm石英比色杯319 nm波长测光密度值，每隔30 s测一次光密度值，共测4 min，求出邻苯三酚的自氧化速率OD/min.同时，用10 mmol/L的盐酸做空白试验.

SOD活性测定[10]：取pH值为8．2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5 mL于10 mL比色管中，25 ℃恒温10 min，加入已恒温至25 ℃的样品溶液10 mL，迅速混匀，于325 nm波长测定密度值，30 s记录一次数据，连续测4～6 min，求出光密度值变化速率OD/min. 酶活性

2)POD酶活性的测定方法.

POD活性的测定采用愈创木酚法测定[11].取比色皿2只，一只中加入反应混合液[100 mmol/L磷酸缓冲液(pH=6.0)50 mL，加入愈创木酚100 μL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢200 μL，混合均匀保存于冰

箱中]3 mL，KH2PO4 1 mL作为较零对照；另一只中加入反应混合液3 mL，上述提取的酶液1 mL，于分光光度计470 nm波长下测量OD值，每隔30 s读数一次，测试时间4～5 min.

定义：酶活力单位(Units)，以每分钟转化1 μmol底物定义为一个酶活单位(u).酶的比活力(Units/mg)，是酶制剂纯度的指标，对于同一种酶来说比活力越高，表明酶越纯.

比活力=活力单位数(Units)/酶蛋白(mg). 过氧化物酶活性

利用文献[12]的方法，本研究测定了牛血清蛋白的标准曲线，结果见图1. 通过牛血清蛋白标准曲线的绘制，得到了回归方程，y=0.0485x+0.0105，其相关系数为，R2=0.9985，线性良好.表明可以利用回归方程计算酶液中蛋白的含量. 取4.5mL 50 mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.2)缓冲液，4.2 mL蒸馏水，混匀后在25 ℃水浴保温20 min，取出后立即加入在25 ℃预热过的0.1 mmol·L-1邻苯三酚0.3 mL(以10 mmol·L-1 HCl配制，空白管用10 mmol·L-1 HCl代替邻苯三酚的HCl溶液)，总体积为9 mL，迅速摇匀倒入比色杯(光径1 cm)在波长325 nm，25 ℃恒温池中，每隔30 s测OD值一次.计算线性范围内每分钟OD的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率[13〗.结果见图2.

通过邻苯三酚自氧化速率标准曲线的绘制，得到了回归方程，

Y=0.0234X+0.1231，其相关系数为，R2=0.9993，线性良好.表明可以利用该回归方程来计算SOD酶液的活性.

利用“1.3.1”项下“1)”的方法测定SOD酶活性，测得水涝处理组和空白对照组欧李植物叶片中SOD酶活性(U/ml)，结果见表1.

利用考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法测定每日提取的SOD酶液中的酶蛋白的含量，连续测定7 d，得SOD酶蛋白含量的变化趋势图，结果见图3.

由图3可看出，在整个实验阶段中，水涝处理组的欧李植物叶片内的SOD酶蛋白含量在前3 d呈下降趋势，在第4 d含量突然增加，第5 d又减少，随后一直呈上升趋势；对照组在实验前3 d呈上升趋势，随后在实验的后期整体呈下降趋势，但有所起伏.

通过比活力计算公式得SOD酶比活力趋势变化如图4所示.

由图4可看出，水涝处理组的SOD酶比活力前72 h呈下降趋势，72～120 h呈上升趋势，之后一直呈下降趋势；空白对照组SOD酶比活力在实验前96 h呈起伏上升，随后一直下降.

利用“1.3.1”项下“2)”的方法测POD酶活力，实测的水涝组和对照组欧李植物叶片POD酶活性酶活性[u/(mg·min)]，结果见表2.

利用考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法，每日提取的POD酶液中的酶蛋白的含量，连续测定7 d，得POD酶蛋白含量的变化趋势，结果如图5所示. 由图5可看出，实验中水涝处理组和空白对照组的欧李植物叶片内POD酶蛋白的含量变化不大，只在144 h时存在略微变化.

通过比活力计算公式得POD酶比活力趋势变化如图6所示.

由图6的POD酶比活力的变化趋势图得出：水涝处理组的欧李植物叶片内的POD酶比活力前24 h呈上升趋势，24～120 h时一直呈下降趋势，在第144 h时突然增大随后又呈下降趋势；空白对照组的POD酶比活力在实验前96 h时呈缓慢上升趋势，但在120 h时突然降低，随后又呈上升趋势.

由SOD和POD酶活性的变化趋势结果表明：随水涝胁迫的增强，SOD和POD活性随着胁迫时间的延长表现出先升高后降低的趋势，这与马建军等[6]的研究结果一致；在中度胁迫时，SOD和POD仍保持较高的活性，且活性值比对照大，但在重度胁迫下其活性均呈下降趋势.欧李植物叶片SOD活性在淹水初期与对照比较存在明显下降趋势，随着水涝胁迫程度加深，由于欧李对淹水胁迫的适应和自身

的调节机制，使SOD酶活性又开始回升成上升趋势，到第4 d升高至最大活性，在胁迫后5d超出对照.说明适度的逆境处理能提高植物的SOD活性，增强抗逆性.随着水涝胁迫的继续增强，其活力又逐渐呈下降趋势.

欧李POD酶的活性在水涝胁迫前期欧李叶片POD活性一直呈上升趋势且整体高于对照，这与POD具有清除H2O2等活性氧的功能而增强植株的抗逆性相一致[14].但随水涝胁迫强度的增大，POD酶的活性反而呈下降趋势，分析认为，POD活性在短期淹水下的快速上升应属植物体对逆境胁迫的一种应激反应，直至第6 d酶活性突然增加，出现这一结果可能存在的原因为气温突然的升高.受水涝胁迫后酶蛋白含量变化都不是很明显，分析认为，在短时的水涝胁迫下，植物体内蛋白的合成与分解可能达到一种相对的平衡.

总而言之，本实验受水涝胁迫处理的SOD酶和POD酶活性都有所提高，且二者存在明显的补偿机制.从水涝胁迫后的变化趋势可推测欧李植物受淹后生理生化变化顺序为：SOD活性受抑制→活性氧增加→SOD、POD活性及可溶性蛋白→清除活性氧→淹水胁迫加深→活性氧再增加→MDA积累→保护酶活性降低→质膜受损，此可作为耐涝性评价的指标.