／ 堕 煎墅笪查 ＣＨｌＮＥＳＥ ＣＯＭＭＵＮｌＷ ＤＯＣＴＯＲｓ 临床免疫ＥＬＩＳＡ方法试验效果分析 郑百波郑百红 此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原 的量呈反比。操作步骤如下：①将特异抗 前将试剂从冰箱冷藏格取出，在室温下平 衡３０—６０分钟。 １３００５１吉林春市人民医院检验科 体与固相载体连接，形成固相抗体。洗 涤。②待测管中加受检标本和一定量酶 标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反 加样：标本为血清时，最好待血清在 乳胶管中５分钟彻底凝固后，再用４ＯＯＯ 转／分钟离心５分钟，使血清和血球、纤维 蛋白完全被凝胶分开；若标本为血浆，必 须使用含抗凝剂血液标本收集管，采血后 必须立即颠倒混合５—１０次，放置一段时 方法类型 双抗体夹心法：①将特异性抗体与固 相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未 应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能 顺利地与固相抗体结合。如受检标本中 含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与 结合的抗体及杂质。②加受检标本：使之 与固相抗体接触反应一段时间，让标本中 的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固 相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的 固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原 与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固 间后，用３０００转／分钟离心ｌ５分钟；若几 天内检测，可放在２～８￣Ｃ冰箱中，若要久 相载体的结合量减少。参考管中只加酶 标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的 结合可达最充分的量。洗涤。③加底物 显色：参考管中由于结合的酶标抗原最 置贮存，则置于一２０％的低温冰箱内（加 样后及时放入３７￣Ｃ水浴箱，加酶结合物 后用吸水纸在加样板表面轻拭吸干，标本 物质。③加酶标抗体：使固相免疫复合物 上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未 结合的酶标抗体。此时固相载体上带有 的酶量与标本中受检物质的量正相关。 较多时，分批加样测定）。如果血清或血 浆标本分离不好即进行加样，加入的血清 易出现凝固，影响阴阳性检测；手工操作 多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测 管颜色深度之差，代表受检标本抗原的 量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含 量越多。 ④加底物：夹心式复合物中的酶催化底物 成为有色产物。 双位点一步法：在双抗体夹心法测定 中，加样板过多造成加样后放人３７℃水 浴箱前等待时间过长（特别是室温较高 时）；另外加完样本再加酶结合物时，酶 捕获法测ＩｇＭ抗体：血清中针对某些 抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同 抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相 抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的 加入和酶标抗体的加入两步并作一步。 这种双位点一步不但简化了操作，缩短了 反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗 抗原的特异性ＩｇＭ常和特异性ＩｇＧ同时 存在，后者会干扰ＩｇＭ抗体的测定。因此 测定ＩｇＭ抗本多用捕获法，先将所有血清 ＩｇＭ（包括异性ＩｇＭ和非特异性ＩｇＭ）固定 在固相上，在祛除ＩｇＧ后再测定特异性 试剂溅出孔外等，均影响结果。 孵育：孵育时加样版贴封片，按说明 书步骤严格控制操作时间；若孵育时未贴 封片，使标本稀释液蒸发，吸附于孔壁，容 易清理不彻底；孵育时间人为延长，导致 非特异性结合，紧附于反应孔周围，不易 清洗，影响结果。 ＩｇＭ。操作步骤如下：①将抗人ＩｇＭ抗体 连接在固相载体上，形成固相抗人ＩｇＭ。 体，测定的敏感性和特异性也显著提高。 单克隆抗体的应用使测定抗原的ＥＬＩＳＡ 提高到新水平。 间接法测抗体：间接法是检测抗体最 常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体 洗涤。②加入稀释的血清标本：保温反应 后血清中的ＩｇＭ抗体被固相抗体捕获。 洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂 质成分。③加入特异性抗原试剂：它只与 洗板：保证洗液注满各孔，洗板机畅 通，洗完板后，最好在吸水纸上轻轻拍干 （选择干净，无或少尘的吸水材料）；合理 安排，尽量缩短洗板时间。若采用手工洗 检测已与固相结合的受检抗体，故称为间 接法。操作步骤如下。①将特异性抗原： 与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除 固相上的特异性ＩｇＭ结合。洗涤。④加 入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在 固相上的抗原反应结合。洗涤。⑤加底 物显色：如有颜色显示，则表示血清标本 板，孔与孔之间液体交叉；采用半自动洗 板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻 底；洗板针堵塞，抽吸不完全，洗板不畅， 导致洗板效果差，均影响试验结果。 去未结合的抗原及杂质。②加稀释的受 检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形 成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相 载体上只留下特异性抗体。其他免疫球 蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗 中特异性ＩｇＭ抗体存在，是阳性反应。 出现问题的原因及解决方法 显色：显色剂尽量临用前配制，不用 过期的显色剂，肉眼可见浅蓝色的显色剂 不能用；加样时保持显色剂不外流，Ａ、Ｂ 液应避免接触金属器械；若显色剂配制后 ＥＬＩＳＡ法操作中的每个环节对试验 原结合，在洗涤过程中被洗去。③加酶标 抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而 使该抗体问接地标记上酶。洗涤后，固相 的检测结果影响较大，如不按常规操作， 可以导致显色不符、花板等情况。 在试验工作中，首先试剂要优良。实 放置时间过长或使用过期显色剂，加显色 剂时溅出孔外造成液体回流，均影响试验 结果。 载体上的酶量就代表特异性抗体的量。 例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标 验室测乙肝两对半及丙肝抗体用的是厦 门新创的试剂，必须严格按照操作步骤进 行操作，同时做好室内质控、室间质评，以 终止液：加终止液时应避免产生气 泡，若加终止液时产生较多气泡，导致假 阳性增加。 羊抗人ＩｇＧ抗体。④加底物显色ｉ颜色深 度代表标本中受检抗体的量。本法只要 更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗 体检测各种与抗原相应的抗体。 严格的工作作风检验每一份标本，才能保 证检测质量。全自动酶标仪的应用，对于 实现ＥＬＩＳＡ标准化检测，提高检测质量 起到了重要作用。 选择试剂：要选择试剂质量优良的检 读板：读板时应保证酶标板清洁，若 酶标板板底不清洁，影响试验结果判定。 若整套试验严格按上述操作，还需在 竞争法：竞争法可用于测定抗原，也 可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检 整个操作过程中保证酶样板和测试试剂 均不能接触次氯酸，实现ＥＬＩＳＡ检测标 准自动化，有效提高检测质量。 抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因 测试剂，严格按照说明书进行操作，操作 １２８中国社区医师・医学专业半月刊２００８年第１９期（第１Ｏ卷总第１９ｆｌ期
