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肝素结合生长因子(HBGF)多肽[发明专利]

来源：欧得旅游网

[19]中华人民共和国国家知识产权局

[12]发明专利申请公开说明书

[21]申请号98809911.X

[51]Int.CI7

A61K 38/18C07K 14/475C07H 21/04C12N 15/63

[43]公开日2000年12月13日[22]申请日98.8.6

[21]申请号98809911.X

[11]公开号CN 1276729A

[74]专利代理机构中国专利代理()有限公司

代理人卢新华谭明胜

[30]优先权

[32]1997.08.07 [33]US [31]08/908,526[86]国际申请PCT/US98/123 1998.08.06[87]国际公布WO99/07407 EN 1999.02.18[85]进入国家阶段日期

2000.04.06

[71]申请人儿童医院研究基金会

地址美国俄亥俄州

[72]发明人D·A·布里格斯托克 P·A·哈丁

权利要求书 3 页说明书 26 页附图 4 页

[]发明名称

肝素结合生长因子(HBGF)多肽

[57]摘要

本发明提供基本上纯的肝素结合生长因子多肽(HBGFs)、编码该HBGFs的核酸和与本发明的HBGFs结合的抗体。所述的HBGF多肽用于诱导骨、软骨和组织形成,子宫内膜的生长和发育,以及加速伤口愈合的方法中。

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权利要求书

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1.一种基本上纯的多肽，其特征在于：

a)具有对应于结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的羧基末端氨基酸的氨基酸序列；

b)与肝素结合并且被大约0.8M盐从肝素中洗脱出来；以及 c)通过还原SDS-PAGE技术，具有大约10-kDa的分子量。 2.权利要求1的多肽，其中该多肽具有从CTGF的N-末端的氨基酸残基247位开始的氨基酸序列。

3.权利要求1的多肽，其中该多肽具有从CTGF的N-末端的氨基酸残基248位开始的氨基酸序列。

4.一种分离的编码具有权利要求1、2或3的任一种氨基酸序列多肽的多核苷酸序列。

5.一种含有权利要求4的多核苷酸的重组表达载体。 6.一种含有权利要求5的表达载体的宿主细胞。 7.权利要求6的宿主细胞，它是原核生物细胞。 8.权利要求6的宿主细胞，它是真核生物细胞。

9.一种抗体，它与权利要求1的多肽结合和与其免疫反应片段结合。

10.权利要求9的抗体，其中所述的抗体为多克隆抗体。 11.权利要求9的抗体，其中所述的抗体为单克隆抗体。 12.一种治疗动脉粥样硬化或纤维变性、硬化或细胞增殖失调的方法，该方法包括把细胞与治疗有效量的如下多肽的拮抗剂接触，所述的多肽特征在于：

a)具有来源于结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的羧基末端氨基酸的氨基酸序列；

b)与肝素结合并被大约0.8M盐从肝素中洗脱出来；以及 c)通过还原SDS-PAGE技术，具有大约为10-kDa的分子量。

13.一种在需要这种治疗的患者中加速伤口愈合治疗的方法，该方法包括把细胞与治疗有效量的含有如下多肽的组合物接触，所述的多肽具有的特征为：

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a)具有来源于结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的羧基末端氨基酸的氨基酸序列；

b)与肝素结合并且被0.8M盐从肝素中洗脱出来；以及 c)通过还原SDS-PAGE技术，具有大约为10-kDa的分子量。

14.权利要求12或13的方法，其中所述的细胞选自表皮细胞、肌肉细胞、结缔组织细胞和内皮细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述的结缔组织细胞选自星形胶质细胞、成纤维细胞、破骨细胞、成骨细胞和软骨细胞。

16.权利要求14的方法，其中所述的肌肉细胞是平滑肌细胞。 17.权利要求14的方法，其中所述的肌肉细胞是心肌细胞。 18.权利要求14的方法，其中所述的内皮细胞是毛细血管内皮细胞。

19.权利要求14的方法，其中所述的表皮细胞是分泌性表皮细胞。 20.权利要求12或13的方法，该方法进一步包括把细胞与选自如下组中的生长因子接触：这些生长因子包括：胰岛素样生长因子(IGF-I)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。 21.权利要求20的方法，该方法进一步包括把细胞与肝素接触。 22.权利要求21的方法，其中肝素的浓度范围大约1μg/ml～100μg/ml。

23.一种鉴定影响权利要求1多肽的活性的化合物的方法，该方法包括：

a)在足以使所述的组分相互作用的条件下，把该化合物与权利要求1的多肽或其生物活性片段或表达权利要求1多肽的重组细胞温育；并

b)测定该化合物对权利要求1多肽的活性或表达的影响。 24.权利要求23的方法，其中所指的影响是抑制权利要求1多肽的活性或表达。

25.权利要求23的方法，其中所指的影响是刺激权利要求1多肽的活性或表达。

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26.一种诊断被疑患有特征在于与HBGF有关的疾病的患者HBGF病情的方法，该方法包括从该患者中获得疑有含HBGF的样品；测定在该样品中的HBGF水平并且把样品中的HBGF水平与正常标准样品中的HBGF水平相比较。

27.权利要求26的方法，其中所述的疾病选自动脉粥样硬化、纤维变性、硬化或细胞增殖失调。

28.一种治疗和HBGF有关的病情的方法，该方法包括给患有所述病情的患者施用治疗有效量的包含在药用可接受的载体中的HBGF反应剂。

29.权利要求28的方法，其中所述的疾病是以细胞过度生长为特征的细胞增殖失调。

30.权利要求29的方法，其中所述的细胞过度生长是由于结缔组织细胞过度生长。

31.权利要求28的方法，其中HBGF反应剂是HBGF拮抗剂。 32.权利要求31的方法，其中所述的拮抗剂是特异地与HBGF多肽结合的抗体。

33.权利要求28的方法，其中所述的疾病是以缺乏细胞生长为特征的细胞增殖失调。

34.一种药物组合物，包括承载于药学上可接受的载体中的治疗有效量的HBGF。

35.一种调节子宫内膜或胎盘膜生长的方法。

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说明书

肝素结合生长因子(HBGF)多肽

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1.发明领域

本发明总得说来涉及生长因子领域，更具体地说涉及肝素结合生长因子(HBGF)。 2.发明背景

生长因子是一类在发育的组织中刺激靶细胞增殖、分化和形成结构的多肽。生长因子的作用依赖于它们与激发细胞内信号传导事件的特异受体的结合。生长因子的实例包括来源于血小板的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、转化生长因子β(TGF-β)、转化生长因子α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)和结缔组织生长因子(CTGF)，这些都是熟知的刺激细胞增殖的生长因子。

PDGF是一种在循环血小板的α颗粒中发现的阳离子热稳定的蛋

白，已知它是诸如成纤维细胞和平滑肌细胞等结缔组织细胞的促有丝剂和趋化剂。由于该分子的这些活性，认为PDGF是一种涉及伤口正

常愈合和病理学上对如动脉粥样硬化和纤维变性病等病情起作用的主要因子。PDGF是由α和/或β链结合组成的二聚体分子。这些链形成异二

聚体或同二聚体，并且迄今为止所分离到的所有结合体均具有生物学活性。

对组织再生和修复中各种生长因子的作用的研究导致发现PDGF样蛋白。这些蛋白具有和PDGF一样的免疫学和生物学活性并能被特异抗

PDGF的抗体所封闭。正逐步认识到多肽生长因子和细胞因子是子宫蛋白的重要一类，这些子宫蛋白可能形成母体子宫和发育的胚胎或胎儿之间的生长信号传导通路。对各种物种中的研究表明，EGF、结合肝素的EGF样生长因子(HB-EGF)、IGF-I、IGF-II、aFGF、bFGF、多

效因子(pleitrophin(PTN))、白血病抑制因子、集落刺激因子-1(CSF-1)和TGF-α可能是涉及这些过程的子宫生长调节分子的成员。 CTGF是富含半胱氨酸分子量38,000的单体肽，它是一种对结缔组织细胞具促有丝和趋化活性的生长因子。CTGF由细胞所分泌，与特异的细胞表面受体相互作用而表现活性。CTGF是与PDGF的α或β链

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基因无关的基因的产物。它是生长调节子家族的一员，这些生长调节子包括小鼠(也称作fisp-12或βIG-M2)和人CTGF、Cyr61(小鼠)、Cef10(鸡)和Nov(鸡)。根据序列比较结果表明，该家庭的成员都

拥有调节结构，由如下部分组成，(1)负责结合的胰岛素样生长因子结构域，(2)负责复合体形成的von Willebrand因子结构域，(3)血小板反应蛋白I型重复片段，该片段可能负责与基质分子的结合和(4)在基质蛋白中发现的假定负责与受体结合的C-末端组件。

人CTGF(hCTGF)的cDNA序列含有1047个核苷酸的开放读框，起始位点在130位而TGA终止位点在1177位，编码一种349个氨基酸的肽。在CTGF cDNA和编码PDGF的α或β链的cDNA之间仅存在40％的序列同源性。

hCTGF开放读框编码一种含有39个半胱氨酸残基的多肽，表明是一

种具有多个分子内二硫键的蛋白。该肽的氨基末端含有疏水信号序列，说明是一种分泌蛋白，在氨基酸序列中的天门冬酰胺残基28和225位为2个N-连接的糖基化位点。在CTGF多肽和由CEF-10mRNA转录体

编码的多肽之间整个序列的同源性为45％；当推测的另外的剪接区被缺失时，该同源性可达到52％。

尽管其任一段肽序列的同源性较少，CTGF与PDGF在抗原性上相关。抗PDGF的抗体对PDGF或CTGF非还原的形式具有高亲和性，而对缺乏生物学活性的这些肽还原结构的亲和力降低10倍。这表明PDGF异构体和CTGF分子之间拥有相同的三级结构区，导致出现共同的抗原表位，

CTGF的合成和分泌通过TGF-β、DMP-2和可能的其他TGF-β超家族蛋白的成员所选择性诱导。虽然TGF-β能在软琼脂中刺激正常的成纤维细胞生长，单独使用CTGF不能诱导成纤维细胞出现该特性。然而，已经表明CTGF的合成和作用对TGF-β刺激不依赖成纤维细胞生长的锚定性是必需的。

有可能CTGF在伤口愈合中作为生长因子起作用。病理学上，推测

CTGF涉及结缔组织细胞过度生长，如全身硬化病、癌、纤维变性病和动脉粥样硬化等病情。

CTGF多肽的初始生物活性是其促原性，或刺激靶细胞增殖的能力。体内该促原活性的最终结果是靶组织的生长。CTGF也拥有趋

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化活性，它是作为与特殊分子相互作用结果的化学诱导细胞运动。发明概述

本发明基于在子宫分泌液中发现、纯化特征描述肝素结合生长因子(HBGFs)。这些生长因子多肽与肝素结合并表现出多种全长CTGF的功能特性。

在第一个方面，本发明提供已被鉴定为具促有丝活性的结合肝素的多肽(HBGF多肽)和编码上述多肽的核酸。

在本发明的另一个方面，提供与HBGFs结合的抗体。

在本发明另一个方面，还提供包括足够长度核酸分子的核酸探针，该探针能与编码HBGFs的核酸序列特异地杂交。

根据本发明另一个方面，提供利用HBGFs、编码HBGFs的核酸分子或针对编码HBGFs的核酸分子的反义序列来治疗伤口愈合、组织形成、硬化或细胞增殖疾病、动脉粥样硬化或纤维变性疾病的方法。附图简述

下列附图是说明本发明的具体实施方案，并不意味着由权利要求所包含的发明范围。

图1a图示子宫腔冲洗液的肝素亲和层析级分用于刺激DNA合成的测定结果。

图1b图示继续肝素亲和层析对DNA合成阳性(根据图1a)的样品的结果，其中主要组分峰(标示为P1和P2)代表HBGF-0.8多肽。图2图示HBGF-0.8多肽的凝胶过滤层析图。

图3a和3b图示HBGF-0.8多肽的反相HPLC和SDS-PAGE的结果。

图4图示非纯化的子宫腔冲洗液的Western印迹分析结果。图5图示HBGF-0.8多肽的促有丝活性作用。

图6图示HBGF-0.8多肽和CTGF初级翻译产物之间的关系。优选的实施方案的详细描述

在描述本发明的方法、仪器、组合物和制剂之前，应当明白本发明并不局限于在此所述的具体方法、仪器、组合物和制剂，因为上述方法、仪器、组合物和制剂当然有可能改变。也应该明白本文所用的术语学仅为了描述具体实施方案的目的，并不意味着仅由所附的权利要求所限定的本发明的范围。

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应该注意的是，在本文及在所附的权利要求中所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的所涉及的对象，除非另外清楚地

注明其内容。因此，例如，所指“一种生物”包括一或多种不同的生物，所指“一种氨基酸”包括一或多种上述的氨基酸，以及所指“一种方法”包括本领域技术人员熟知的所涉及的相等步骤和方法，等等。

除非另有说明，本文所采用的所有的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员所通常理解的相同含义。虽然与在此所述的那些相似或相等的任何方法和材料能用在本发明的实践或检测中，但在此所描述的是优选的方法和材料。上述讨论的公开物仅仅是作为在本发明申请日前的公开而提供的。本文的任何内容都不能被认为是承认本发明由于借助于先有发明而没有权利早于这些公开内容。

本发明提供肝素结合生长因子(HBGF多肽或HBGFs)，这些因子体外刺激成纤维细胞和平滑肌细胞有丝。HBGFs对热和酸不稳定，并以HBGF-0.8-P1和HBGF-0.8-P2的2种形式存在，其中每一

种具有不同的结合肝素的特性，并且其中的每一种形式具有在还原条件下通过SDS-PAGE显示的分子量大约为10kDa。HBGFs在结构和功能上与CTGF有关。从肝素亲和柱上抽提时，HBGF-0.8-P1和HBGF-0.8-P2两者需要0.8M NaCl的存在。序列测定显示HBGF-0.8-P1的N-末端序列相当于猪结缔组织生长因子(CTGF)的推测349个残基的初始翻译产物的247-262位氨基酸残基，而HBGF-0.8-P2的N-末端序列相当于CTGF的248-259位氨基酸残基。因此，HBGFs相当于2种CTGF翻译产物的微小异源高度截短的N-末端结构，这两者均具有生物学活性。除了HBGF-0.8-P1的N-末端存在一个额外的Glu残基外，HBGF-0.8-P2和HBGF-0.8-P1相同。本发明的HBGFs是CTGF的N-末端高度截短的结构。然而，不存在能直接产生2种蛋白的N-末端的内含子外显子边界。HBGFs不和建议的CTGF调节组分相匹配；本发明的蛋白不含有任何CTGF的硫酸化糖结合物的结合基元，该基元称为血小板反应蛋白I型重复片段，它被

假定为负责与基质分子的结合。假定为涉及受体结合在基质蛋白中找到的CTGF C-末端组件完全存在在HBGFs中。在CTGF的206和214

位氨基酸残基之间负责硫酸化糖结合物的建议结合基元，在HBGFs中缺乏，在HBGFs结合肝素中也缺乏，并且与肝素的相互作用功能上十分重

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要。HBGF-0.8-P1和HBGF-0.8-P2的N-末端可能涉及与肝

素结合，因为本发明的2种蛋白仅是单一的N-末端Glu的不同，而表现为对肝素的不同结合特性。

本发明的HBGFs从培养的人和小鼠成纤维细胞中分泌。HBGFs的产生并不局限于特殊的物种或生物体系。优选地，本发明的HBGFs对间充质起源的细胞(如成纤维细胞、软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞和星形胶质细胞)具有促有丝活性和趋化性，然而，其他细胞类型(如肌肉细胞、结缔组织细胞、表皮细胞和分泌细胞)也对HBGFs有反应。HBGFs能在人组织的正常发育、生长和修复中起重要的作用。HBGFs

存在于子宫的冲洗液中，可能在子宫内膜的生长和重新改变形状中起额外的作用，并在妊娠期间，可能影响胚胎外或胎盘膜的生长和发育。来源于HBGFs的治疗剂可用于增强在某些临床状态中(如，伤口愈合)涉及结缔组织的正常和受损的生长过程。当这些HBGFs与病理情况

有关时，来自这些蛋白的治疗开发药物能被用于控制或调节不受控制的组织生长。

在此所用的术语“基本上纯”指的是HBGFs基本上无天然与它们相关的其他蛋白、脂类、碳水化合物或其他物质。基本上纯的HBGF多肽将在非还原聚丙烯酰胺凝胶上产生单一的主泳带。HBGFs的纯度也能通过氨基末端的氨基酸序列分析确定。只要保留HBGF的生物学活性(例

如，用本领域通用的标准测定方法和本发明所介绍的方法确定的诱导在成纤维细胞中的生物学反应)，在此所定义的HBGFs包括所述多肽的功能性片段。含HBGF生物学活性的较小多肽也包括在本发明中。另外，包括例如通过对HBGF多肽cDNA定点诱变产生的更有效的HBGFs。“重组的”HBGFs指的是通过重组DNA技术产生的HBGF多肽；即由外源的编码所需HBGF多肽的DNA构建体所转化细胞产生。“合成的”HBGFs是通过化学合成法制备的那些种类。DNA“编码序列”或编码具体HBGF多肽的“核苷酸序列”是一种这样的DNA序列，即当该DNA序列被置于合适的调节序列控制下，被转录并翻译成HBGF多肽。

本发明提供编码HBGF多肽的核酸。这些核酸包括对HBGFs编码的DNA、cDNA和RNA序列。应当明白，编码全部或部分HBGF多肽的所有核酸也包括在本发明中，只要它们编码的多肽具有HBGF生物学活性。上述核酸包括天然产生和有目的地操作产生的核酸。例如，HBGF

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多肽可被进行定点诱变。

本发明的核酸包括因遗传密码的原因简并的序列。仅存在20种天然的氨基酸，其中的多数由一个以上的密码子指定。因此，只要HBGF多

肽的氨基酸序列功能上没有变化，所有简并的核苷酸序列包括在本发明中。HBGF多肽的片段、衍生物或类似物可能是(i)一种如下的类型，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)所替换，并且上述替换的氨基酸残基可能通过遗传密码编

码或不由遗传密码编码，或者其中优选的变异体是由保守氨基酸替换与参照序列不同的那些种类，(上述替换是在一多肽中由相似特性的另一

个氨基酸替换一个给定的氨基酸。典型地，保守性替换是一个转变为另一个，脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间进行的取代物；疏水残基Ser和Thr互换，酸性残基Asp和Glu交换，酰胺残基Asn和Gln的替换，碱性残基Lys和Arg的交换和芳香性残基Phe、Tyr的取代物)；(ii)一种一个或多个氨基酸残基包括取代基团的类型；(iii)一种如下的类型、其中HBGF多肽和另一化合物融合，例如增加HBGF多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)；或者(iv)一种如下的类型，其中HBGF多肽与另外的氨基酸融合，例如引导或分泌序列或用于纯化HBGF多肽

的序列或者前蛋白序列。根据本发明介绍的方法，上述片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员掌握的范围之中。本发明的HBGFs和编码它们的核酸优选地以分离的形式提供，并且优选地纯化为均质性。编码本发明HBGF多肽的DNA序列能通过几种方法得到。例如，能用众所周知的杂交方法分离DNA。这些方法包括，但不局限于：1)探针与基因组成cDNA文库杂交以检出共有的核苷酸序列(例如见：现代分子生物学方法，Ausubel F.M等(编著)、绿色出版公司协会和John

Wiley Interscience、纽约，现时版)，和2)抗体筛选表达文库以检出共有的结构特征。本领域的技术人员应当理解编码HBGFs的核酸(包括至少12个毗邻的核苷酸)特别适用作探针。

在此所用的“选择性杂交”指的是在中度严格或高度严格生理条件下杂交(见J.Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室(现时版)，其全文在此引入仅作参考)，该杂交条件将把与有关和无关的HBGF区别开来，其原理依据相似的核苷酸序列之间发生杂交时的一致性程度。另外，应当明白为95bps长度的100bps序列和从由其获得的

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100bps序列具有95％一致性。正如此处所用的，在第一序列的碱基和另一序列的碱基之间，当如通过BLASTN排列而互相适当地排列时，如果分别为至少70％优选地至少80％或90％一致性，即第一DNA(RNA)序列与另一DNA(RNA)序列至少70％和优选地至少80％一致。

在此所用的术语“一致性”指的是多核苷酸序列包含的作为参照多核苷酸相同碱基的百分率。例如，一种与参照多核苷酸至少90％一致的多核苷酸拥有的多核苷酸碱基组成参照多核苷酸90％一致的碱基(即，当用本领域通用的那些标准排列和同源性调整法(如，NetBlast或GRAL)将序列互相之间适当排列时)，而可能包括在该多核苷酸序列具有10％不同的碱基。

只要得到合适的探针，依靠核酸杂交的筛选方法有可能从任何生物中分离任何基因序列。例如，相应于编码所研究蛋白的部分序列的寡核苷酸探针，能用化学法合成。这需要必须已知短的、寡肽片段的氨基酸序列。编码该蛋白的DNA序列能从遗传密码推导出来，不过，必须考虑

密码的简并性。有可能当该序列变性时进行混合添加反应。这包括变性双链DNA的异源混合物。对于上述筛选方法，杂交优选地在单链DNA或变性的双链DNA上进行。杂交特别适用于检测来源于如下生物材料的cDNA克隆，其中在该生物材料中存在与目的多肽相关的极其低含量的

mRNA序列。换言之，通过使用针对避免非特异结合的选择性杂交条件，例如有可能在混合物中由靶DNA与其完全互补的单一探针的杂交而放射自显影显示特异的cDNA克隆(Wallace等，核酸研究，9：879，1981)。也应该明白上述选择性杂交探针能被标记，并且优选地可被可

分析可检测的试剂标记，以便于确定该探针。有用的试剂包括但不局限于放射性、荧光染料或能催化形成可检测产物的酶类。因此，该选择性杂交探针可用于从其他生物来源中分离互补拷贝的DNA或从上述生物来源中筛选有关的序列。

用对HBGF多肽特异的抗体或能和HBGF多肽交叉反应针对CTGF的抗体或能和HBGF多肽交叉反应针对PDGF的抗体，间接地从如λgtll的cDNA表达文库中筛选至少具有一个表位的HBGFs。上述抗体可能多克隆或单克隆来源，并可用于检测显示HBGF多肽cDNA存在的表达产物。

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编码HBGF多肽的DNA序列可通过DNA转移到合适的宿主细胞中体外来表达。“宿主细胞”是含有本发明载体的遗传工程化细胞(转导或转化或转染)，所述的载体例如可能是克隆载体或表达载体。载体可

能是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。工程化的宿主细胞可培养在为激活启动子适当修饰的常规营养培养基中，以选择转化体或扩增本发明的基因。培养条件如温度、pH等是以前选择该宿主细胞用于表达所采用的那些、对本领域普遍技术人员是显而易见的。该术语也包括受试验的宿主细胞的任何后代。应当明白所有的后代可能与亲本细胞不一致，因为在复制过程中会出现突变。然而，当用术语“宿主细胞”时上述后代包括其中。把构建体导入到宿主细胞能通过磷酸钙转染、DEAE葡聚

糖介导的转染、电穿孔或任何本领域的其他方法实现(Davis，L.等，分子生物学的基本方法，(现时版))。

本发明的核酸可通过重组技术用于生产HBGFs。因此，例如，该多核苷酸可被包括在各种表达HBGF多肽的表达载体的任何一种中。上述载体包括染色体、非染色体和合成的DNA序列，如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、来源于质粒和噬菌体DNA组合的载体、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病毒。然而，可用任何其他的载体，只要它能宿主中复制并存活。合适的DNA序列可通过各种方法插入到载体中。一般来说，DNA

序列用本领域熟知的方法插入到合适的性核酸内切酶位点中。可认为上述方法和其他方法在本领域的技术人员掌握的范围之内。编码HBGFs的DNA序列能在原核或真核生物中体内表达。在原核生物中，表达具有真核生物编码序列的DNA序列的方法在本领域众所周知。宿主包括微生物、酵母和哺乳动物。

能在宿主中表达和复制的具有生物学功能的病毒和质粒DNA在本领域众所周知。用上述载体掺入本发明的DNA序列。一般来说，含有启

动子序列的表达载体用于和宿主连接，启动子序列有利于插入的直核遗传序列的有效转录。表达载体通常含有一个复制起始点，一个启动子和一个终止子，以及能提供表型选择转化细胞的特异基因。

除了本领域熟知的诸如细菌、酵母和哺乳动物表达系统等表达载体外，也可用杆状病毒载体。在该无脊椎动物病毒表达载体表达外源基因的一个优点是它能高水平地表达重组蛋白，该重组蛋白在抗原性和功能

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上与它们天然的对应物相似。用于结合所述的载体的杆状病毒载体和合适的昆虫宿主细胞对本领域的技术人员来说众所周知。分离和纯化表达本发明多肽的宿主细胞可通过任何常规方法进行，例如制备性层析分离法和诸如涉及应用单克隆或多克隆抗体的免疫分离法。

本发明提供特异地和HBGF多肽或其片段反应的抗体。尽管该多肽可能和针对PDGF或CTGF的抗体交叉反应，不是所有针对HBGFs的抗体也和PDGF有反应，而不是所有针对CTGF的抗体对HBGFs有反应。

提供了基本上由具有不同表位特异性的富集单免隆抗体和不同单克隆抗备物组成的抗体。通过本领域众所周知的方法(Kohler，等，自然256：495，1975；分子生物学当代方法，Ausubel等编著，19)，从含有该蛋白片段的抗原中制备单克隆抗体。用本领域常见方法(见

Harlow和Lane，1988，抗体，实验室手册，冷泉港实验室，纽约，现时版)，也包括针对本发明的HBGFs的多克隆抗体。选择出对HBGFs特异的单克隆抗体，例如通过筛选和HBGF多肽有反应但不和PDGF有反应的杂交瘤培养上清液。产生抗相应于本发明的HBGFs的抗体可通过把

多肽直接给动物注射或把多肽给动物，优选地非人类施用而获得。由此获得的抗体接着将与该多肽自身结合。用这种方法，能用甚至是编码仅为多肽的一个片段的序列产生结合原始多肽的抗体。然后用上述抗体从表达该多肽的细胞中分离该多肽。

为制备单克隆抗体，能用提供由经连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。实施例包括杂交瘤技术(Kohler等，自然256：495，1975)，三瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学4：72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.77-96页)。

能采用产生单链抗体所披露的技术(美国专利4,946,778)，产生针

对本发明免疫原肽产物的单链抗体。此外包括在本发明范围之中的是针对HBGF多肽或其版段的“人”和“人源化”抗体的制备以及在论断和治疗应用方面的用途。人源化抗体是与亲本抗体(即通常为小鼠来源)

具有相同的结合特异性，但增加了人特性的抗体或抗体片段。人源化抗体可由键重组术或用噬菌体展示技术得到。例如将包含对HBGF特异的非人抗体的重或轻链可变结构域的多肽与人互补(轻或重)链可变结构

域库混合。选择对目的抗原特异的杂交配对物。然后来自选出的配对物

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的人源链和人互补可变结构域(重或轻)库混合，然后能选出对抗原结

合特异性的人源化抗体多肽二聚体。上述技术在美国专利5,565,332中披露，或可购买得到(Scotgene，Scotland or Oxfbrd Molecular，PaloAlto，CA，美国)。此外，也能采用披露的在转基因小鼠中生产“人”抗体(即，从头形成具有人稳定区序列的抗体)的技术(美国专利号5,5,806和美国专利号5,569,825)，产生“人”HBGF抗体或抗体片段，或也可商业途径委托生产(GenPharm International，Inc.，Mountain View，CA，美国)。

产生的抗本发明多肽的抗体可用于从其他生物或样品中筛选相似的HBGF多肽。上述筛选技术在本领域众所周知。

本发明提供一种受试者如人中，通过给受伤者施用治疗有效量的含有纯化的HBGF多肽、PDGF、PDGF相关分子或其结合物的组合物来加速伤口愈合的方法。本发明的HBGF多肽作为治疗剂在这些病例中是

有效的，这些病例需要皮肤伤口的损伤愈合或需要增强正常愈合机制。HBGF多肽或其功能性片段，比熟知的涉及伤口愈合的PDGF和其他生长因子更稳定并对蛋白酶降解更不敏感。此外，HBGF多肽可能比CTGF具有更高的特异生物活性。

HBGF多肽来源于成纤维细胞，其存在于伤口部位。因此，能把刺激HBGF多肽产生的药剂加到用于加速伤口愈合的组合物中。优选地，药剂是生长因子家族的成员。如胰岛素样生长因子(IGF-I)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子贝塔(TGF-β)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。更优选地，该药剂是转化生长因子贝塔(TGF-β)或TGF-β的超家族的其他成员。此外，HBGF的生物学效应可通过添加浓度范围大约为1μg/m1～100μg/ml的肝素调节。本发明的HBGF组合物部分通过促进结缔组织的

生长有助于愈合伤口。通过在任何药用可接受的载体物质，如惰性的凝胶或液体中混合本发明纯化的HBGF多肽而制备HBGF组合物。其他调节组合物如肝素或诸如TGF-β的生长因子也包括在HBGF组合物中。

术语“细胞增殖失调”指的是特征在于异常细胞数的病情。该病情可包括过度细胞生长(细胞的连续增殖导致组织中细胞群体的过度生长)和细胞生长低下(组织中缺乏或缺少细胞)，或者细胞过度地流动

或迁移到人体的一个区域。细胞群体不必为转化的、致瘤性或恶性细胞，

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也可包括正常细胞。例如。HBGFs可能参与由诱导在主脉壁的内膜层增

殖损伤而导致动脉粥样硬化的病理情况。除了设法减少该病情的危险因子，如降低血压或降低升高的胆固醇水平外，本发明的HBGF多肽抑制剂或拮抗剂可用于干扰和动脉粥样硬化有关的体内HBGF活性。HBGF

多肽拮抗剂也用于治疗和结缔组织过度生长有关的其他失调，例如包括硬皮病、关节炎和肝硬化等各种纤维变性疾病。

由HBGF调节的疾病、失调或病痛包括外伤性损伤后的组织修复，

或者包括关节炎、骨质疏松症和其他骨骼失调及烧伤的疾病。因为这些问题是由于在损伤部位的成纤维细胞、干细胞、软骨细胞、成骨细胞或成纤维细胞的微弱生长反应，添加刺激或诱导这些细胞生长的生物活性药剂是有益的。在此所用的术语“诱导”或“诱导性”指的是活化、

刺激、增强、启动和/或细胞机制的维持，或形成任何组织必需的过程，如在此所述的修复过程或发育。

本发明进一步提供调节雌性生殖道功能的方法。已经表明：在周期性有丝和子宫内膜细胞组分的分化、在蜕膜化子宫内膜中巨噬细胞的重新集结、子宫内膜-滋养层相互作用、早期妊娠维持和子宫内膜功能性再生中，生长因子均起作用。在此所用的术语“调节”解释为对现存疾病或生物学状态的调节。在此所定义的状态的调节包括增加或降低影响现存状况的决定因素。例如，可施用HBGFs以在需要促进生长的状况中增强子宫功能。例如，可用HBGFs治疗子宫以促进胎盘膜的生长和发育或子宫内膜生长。此外，可用HBGFs治疗，通过有利于子宫内膜滋养层相互作用而促进和维持妊娠。另外，施用针对HBGFs的拮抗剂调节子宫内膜过度生长的状况，与正常生物学状况相比较，该状况中HBGF的水平过度。

本发明还公开了一种通过用治疗有效量的HBGF反应剂治疗特征为

细胞增殖失调的病情的方法。术语“治疗”表示在接受该反应剂的受试者中减少病情的有害影响。如果病情是由于细胞的过度生长，HBGF的拮抗剂在降低与在细胞上HBGF特异受体结合的生长因子的数量中治疗有效。上述拮抗剂可以是HBGF特异抗体或其功能性片段(如Fah，F(ab)2)。治疗需要把HBGF多肽的拮抗剂接触或输送到疾病的部位。如果细胞增殖失调是由于减少的生长的细胞数量，将刺激性HBGF反应剂接触或输送到疾病的部位。例如，TGF-β(或TGF-β超家族的另一

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成员)就是这样的反应剂。其他生物学药剂在本领域的技术人员中众所周知。

当细胞增殖失调和HBGFs的表达相关时，直接干扰HBGF转录成mRNA或HBGF mRNA翻译成蛋白的治疗方法是可能的。例如，与HBGF mRNA结合或降解它的反义核酸或核酶也包括在本发明之中。反义RNA或DNA分子特异地和靶基因RNA信使分子结合，阻断该基因的蛋白产物的表达。反义分子与mRNA结合，形成细胞不能翻译的双链分子。大约15～25个核苷酸的反义寡核苷酸是优选的，因为它们容易被合成并且正如反义RNA分子一样具有抑制效应。此外，化学反应基团，如铁连接的乙二胺四乙酸(EDTA-Fc)能连接到反义寡核苷酸上，引起在杂交位点的RNA裂解。抑制基因体内翻译的反义方法的这些和其他用途在本领域中众所周知(如，De Mes maeker，等，1995，在寡核苷酸和肽核酸系统中的骨架修饰。结构生物学现代观点5：343-355；Gewirtz，A-M等，1996b.易于反义寡脱氧核苷酸的输送：辅助忠实地反义输送；美国国家科学院院报93：3161-3163；Stein，C.A.G-四

联体的讨论1996.探索反义分子的潜力：超出硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸之外化学和生物学3：319-323)。

包括在本发明中的另一种治疗方法涉及通过任何常规施用技术(例如，但不局限于局部注射、吸入或全身施用)，把包括本发明的HBGFs

的反应剂或组合物直接施用于患有纤维片、硬化或细胞增殖失调、动脉粥样硬化的患者。正如上面所述加速伤口愈合施用HBGFs能诱导组织修

复或再生的形成或子宫内膜的生长和发育。通过在此所述的任何方法或任何本领域熟知输送、靶向和表达编码HBFG基因的方法，也可把反应

剂、制剂或组合物靶向到特异的细胞或受体。调节纤维变性失调、硬化失调、细胞增殖失调、动脉粥样硬化或伤口愈合的反应剂、制剂或组合物的实际剂量，依赖于许多因素，包括生物的体积和健康状况。然而，本领域普通技术人员可使用下列描述的用于确定临床剂量的技术和方法的教导(Spliker B.临床研究和开发方法指南，Raven出版书籍有限公司，纽约，1984，7-13，-60页； Spilker B.，临床试验指南，Raven出版有限公司，纽约，1991，93-101页；Craig C.和R.Stitzel

编著，现代药理学，第二版，Little，Brown和Co.，Boston，1986，127-33页；T.Speight编著，Avery氏药物治疗：临床药理学和治疗学的原理和

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实践，第三版，Williams和Wilkins，Baltimore，1987，50-56页；

R.Tallarida，R.Raffa和P.McGonigle，普通药理学的原理，Springer-Verlag，纽约，1988，18-20页)，或者测定所用的合适剂量；但是，一般说来包括终浓度范围大约0.5μg/ml-500μg/ml，与任何药学上可以解释的载体一起每天给成人给药。

本发明也提供一种检测患者中异常的HBGFs水平的存在，以确定和HBGFs异常水平相关的疾病或病情的存在的方法。上述病情包括但不局

限于细胞增殖失调、包括硬化病的各种纤维变性病情、关节炎、肝硬化和纤维变性子宫。例如，从患者中获得怀疑含有HBGFs的样品，测定HBGF多肽的水平并与正常组织样品中的HBGF多肽水平相比较。HBGFs的水平，例如能用抗HBGF多肽的抗体的免疫测定法确定。上述测定法的其他变化方法包括放射性免疫测定(RIA)：ELISA和免疫荧光。另外，为了相同的目的能用核酸探针检测和定量HBGF的多肽。

给出下列实施例，目的是为本领域的一般技术人员提供如何制取和应用本发明的HBGFs的完全公开和描述的内容，但不应该认为或者将它

们解释为本发明者所认定的他们的发明内容的范围。努力保证所用数字的准确性(如数量，时间、温度等)，但应考虑到某些实验的误差

和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是分子平均重量，温度是摄氏度而压力是位于或接近大气压。实施例1 HBGF多肽的特征描述和纯化

从大约8个月或更低龄的来自屠宰场的猪中随机收集子宫。每个子宫角用冷(4℃)磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，以收集子宫腔组分。生长因子纯化在从多至120头动物中得到的4-升ULF总收集液中进行。在13,500Xg 4℃离心30分钟分离子宫腔冲洗液(ULF)，并将上清经玻璃棉过滤。

4升清亮的ULF上清液样品在4℃加到BioRex 70阳离子交换柱(5×6cm；Bio-Rad)上，该柱使用前用含0.2M NaCl的PBS平衡。加上样品后，该柱用500ml含0.2M NaCl的PBS洗涤，然后用在PBS中500ml的0.2-2M NaCl梯度洗脱结合的蛋白。流率为3.5ml/min的通

量；用NaCl梯度处理柱的过程中收集10ml级分。选出显示对Balb/c 3T3

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成纤维细胞具有促原活性的级分用于下一步的用途。所有后续的层析步骤在室温下进行。

ULF的离子交换层析显示被0.3～0.6M NaCl抽提从BioRex 70柱

上洗脱的部分，存在对Balb/c 3T3细胞的阳离子性生长因子活性。肝素亲和层析表明存在一种另外的未鉴定的HBGF多肽，该多肽需要从EconoPac肝素柱中用0.8M NaCl洗脱。至于从柱上重新获得生物活性的量，需要0.8M NaCl洗脱的级分似乎主要是针对3T3细胞的阳离子性肝素结合生长因子。来自肝素亲和柱的HBGF多肽的洗脱位置与PDGF、HB-EGF、PTN、aFGF、bFGF和双调蛋白明显不同。与热(100℃ 2分钟或56℃ 30分钟)或酸(pH2.0 2分钟)接触后损害HBGF的促原活性。

使用凝胶过滤层析显示：HBGFs拥有表观相对分子量大约为10,000道尔顿。为进行这些研究，来自30只动物ULF的EconoPac肝素亲和FPLC的含0.8M NaCl洗脱液的0.5ml级分，以0.5ml/min加到安有SW保护柱(4cm×8mm，10-μM；TosoHaas)的TSK G2000 SW FPLC柱上(30cm×8mm，10μM颗粒体积，M，500-100,000分级范围；TosoHaas)。用含0.3M NaCl的PBS洗脱蛋白。收集200ul级分并测定它们在3T3细胞中刺激DNA合成的能力。柱校正用EGF(6,000MW)、乳清蛋白(14,200MW)、胰蛋白酶抑制剂(20,100MW)和卵清蛋白(45,000MW)。如上所述，以40μl/ml测定各级分在3T3细胞中刺激DNA合成的能力。

收集含有HBGF活性的级分(阳离子交换层析和肝素亲和层析后收集的级分16-19)，稀释、然后用Tsk肝素5PW柱进行肝素亲和FPLC的第2个循环。为进行第2次肝素亲和纯化步骤，从EonoPac肝素纯化步骤收集含有0.8M NaCl洗脱液具有生物学活性的HBGF级分，用20mM Tris-HCl(pH7.4)稀释3倍，然后经0.2μM滤膜过滤分离。该样品以2ml/min加到TSK肝素5PW柱上(0.8×7.5cm；TosoHaas，

Philadelphia，PA)。除了从缓冲液中删去CHAPS外，按上面所述的方法清洗和洗脱，并且以0.5ml收集级分。被0.8M NaCl抽提并表明有3T3细胞丝裂原活性的含有蛋白的级分，被分为由级分31-34(峰1)和级分35及36(峰2)组成的2组。再次用0.8M NaCl洗脱HBGF多肽(级分31-36)，但分离为具有不同结合肝素特性的2个促原活

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性峰。对级分31-34，活性峰命名为HGBF-0.8-P1而对级分35和36命名为HGBF-0.8-P2。

调节HBGF-0.8-Pl和-P2至10％乙腈、0.1％三氟乙酸，然后分离进行C8反相HPLC。反相HPLC在日立HPLC系统(日立仪器公司，Danbury CT)上进行，用C8柱(0.46×25cm，5μM颗粒体积；Rainin仪器公司，Wobum，MA)，该柱用含10％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)三氟乙酸的水平衡。分别调节来自TSK肝素纯化步骤的含有峰1和2的合并级分，这样它们含有10％乙腈、0.1％三氟乙酸，然后经0.2μM滤膜过滤分离。洗脱结合蛋白的条件为注射样品后从0～10min 10％乙腈，从l0min～146min 10～90％乙腈。流速为1ml/min通量，按所述方法(Bray和Brigstock(1994)美国实验室杂志26，38)保存层析谱图(A214)。按0.5ml级分用硅化过的离心管收集洗脱液，该离心管中含有50μl 125mM NaOH以立刻中和三氟乙酸。所选择级分的80μl等份试样在SpeedVac浓缩仪(Savant仪器公司，Farmningdale，NY)中挥发干燥，然后在25μl 10mM Tris-HCl(pH7.4)重制成溶液。10μl该浓缩液用于刺激3T3细胞DNA合成的测定，而10μl用于进行分析性SDS-PAGE。对于第二步C8HPLC纯化，收集来自第一次HPLC步骤的2个活性级分(1ml总体积)，用水，0.1％三氟乙酸稀释5倍，按在此所述的相同层析洗脱条件进行。HGBF-0.8-P1和-P2的洗脱位置，通过级分被蒸发并用PBS重新制成溶液后生物测定含有柱洗脱液级分等份而确定，结果表明尽管HPLC步骤中与pH＝2延长时间接触(大约30～40分钟)，在纯化的HGBF样品中存在足够的活性以允许它们的检测和进一步描述特性。

HPLC后，如上所述(Kim，G.Y.等(1995)生物生殖杂志52，561-571)，用18％聚丙烯酰胺微型胶在还原条件下，进行含HBGF-0.8-P1或-P2的级分的银染SDS-PAGE分析。接着，按所述的方法(Wray，W等(1981)分析生物化学118，197-203)进行蛋白的银染色。在(i)HPLC纯化的生长因子，(ii)8μl未分级化的ULF或(iii)在10mMTris-HCl，0.5M NaCl(pH7.4)存在下经20μl肝素-葡聚糖床过滤并接着用SDS-PAGE样品缓冲液的肝素珠抽提后100μl的ULF。然后按所述的方法(Kim，G.Y.，等(1995)生物生殖杂志52，561-571)制备凝胶。接着的分析显示存在和Balb/c 3T3促有丝活性共纯化

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的单一10-kDa蛋白促有丝活性的水平与10-kDa蛋白的那些直接

相关，该蛋白经银染色显示为完全纯。18个不同的HPLC纯化结果确认

10kDa蛋白和HBGF-0.8-P1和-P2的丝裂原活性之间直接的因果关

系。

各纯化步骤的分析显示0.5～1.1μg的HBGF-0.8-P1或-P2均

从324mg的粗ULF蛋白纯化得到，并且与在1升开始材料的66,666单位

相比较，经第一次HPLC步骤后回收了HBGF-0.8-P1或P2的10-

22活性单位(表1)。应该注意到HBGF肽-0.8活性的明显低的回收

率是因为(i)对整个3T3细胞促有丝活性主要由IGF、EGF、

PDGF、HB-EGF和PIN起作用而部分是纯化的样品的作用(2，8，

9，12，25-27)，(ii)在HPLC分离步骤中HBGF肽-0.8丝裂原活

性的酸不稳定性。尽管设法用其他方案回收较高特异活性的纯化的生长

因子，不可能避免使用反相HPLC或用作离子配对的三氟乙酸而不损害

最终产物的纯度。虽然在它们的生物活性方面，HBGF-0.8-P1和-

P2的回收有点受到损害，但容易获得所述蛋白的结构特征，因为它们保

留足够的活性明确地归因于在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中单一均质的10

-kDa泳带，并且从几升ULF中分离足够量的每种蛋白(表1)。

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表1

纯化步骤重新获得 ED50 总活性重新获得纯化的蛋白的活性因子 ng ng/ml 单位％粗制ULF 3.4×10 25,650 66,666 100

BioRex 70 2.2×10 3825 28,9 43 77

EconoPac Hep 4.8×105 3225 744 HBGF-0.8-P1

TSK-Hep 2.1×105 2230 473 Cd

8HPLC，步骤1 1100 250 22 Cd8HpLC，步骤2 100 25 20 HBGF-0.8-P2

TSK-Hep 2.9×104

417 347 Cd

8HPLC 500 250 10 a

产生50％最大DNA合成所需的HBFG-0.8制备物的浓度b

1单位的活性是产生ED50所需的HBGF-0.8的量c

和粗制ULF相比较

由于酸接触降低的生物活性

实施例2 HBGF多肽的测序

合并含有HPLC纯化的生长因子级分，干燥，然后进行制备性SDS-PAGE。凝胶中的蛋白用10mM CAPS缓冲液(pH11)在300mA

持续90min，被转移到聚偏1，1-二氟乙烯膜上。目的蛋白的位置用在50％甲醇中的0.1％考马斯亮蓝R-250染色膜2min，接着用50％甲醇，10％乙酸脱色来确定。将每种10kDa蛋白泳带切下一半，然后在型号470A气相测序仪(应用生物系统，Foster城，CA)上进行N-末端氨基酸测序。乙内酰苯硫脲衍生物通过C18反相HPLC鉴定。从HBGF-0.8-P1

1.1 0.7 0.03 0.03 0.5 0.015 8 11 1031026 62 103

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获得一条16-残基的序列，在部位10有一个未确定的残基，而从HBGF-0.8-P2获得一条12-残基的序列，在部位9有一个未确定的残基(表2)。这些数据表明除了在HBGF-0.8-P1的N-末端存在一个额外的Glu残基外，HBGF-0.8-P1和-P2在N-末端是相同的。检索

GenBank表明这些序列和下列分子的预测的内部序列完全重叠，这些TM

分子是hCTGF和小鼠fisp-12(也称为β1G-M2)、CTGF的鼠同源物(Bradham，D.M.，等，(1991)细胞生物学杂志，114，1285-1294；Ryseck，R-P.，等，(1991)细胞生长分化2，A.等，(1991)DNA细胞生物学10，293-300)。在HBGF-0.8-P1的循环10和HBGF-0.8-P2的循环9中未排列的残基相当于hCTGF的Cys

256

和fisp-12的Cys

255

(表2)。

225-233；Brunner，98809911.X说明书第19/26页

表2

HBGF-0.8-P1(SEQ ID NO：1) Glu-Glu-Asn-Ile-Lys-Lys-Gly-Lys-Lys-Xaa-Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile

HBGF-0.8-P2(SEQ ID NO：2) Glu-Asn-Ile-Lys-Lys-Gly-Lys-Lys-Xaa-Ile-Arg-Thr 人CTGF-(247-262) Glu-Glu-Asn-Ile-Lys-Lys-Gly-Lys-Lys-Cys-Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile

fisp-12-(246-261) Glu-Glu-Asn-Ile-Lys-Lys-Gly-Lys-Lys-Cys-Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile

猪CTGF-(247-262) Glu-Glu-Asn-Ile-Lys-Lys-Gly-Lys-Lys-Cys-Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile

abcde

edc

重复产率＝88％；起始产率-7pmol重复产率＝90％；起始产率-7pmol

见Bradham et al.细胞生物学杂志114：1285-1294，1991.见Ryseck et al.细胞生长分化2：225-233，1991来自本研究中的cDNA分析

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为证实HBGF-0.8-P1和-P2的部分序列确实在猪CTGF

(pCTGF)分子中存在，用P标记的hCTGF探针杂交筛选猪子宫内膜cDNA文库来分离全长的pCTGF cDNA。为进行这些研究，按所述的方法(Kim，G.Y.等，(生物生殖杂志52，561-571(1995))，获得猪子宫内膜总RNA。用poly(A)Tract mRNA分离系统(Promega，Madison，WI)分离poly(A)RNA，用Moloneg鼠白血病病毒逆转录酶和含有XhoI的寡(dT)连接引物，将5μg的poly(A)RNA进行第一链的cDNA合成。第二链合成通过用RNase处理mRNA-cDNA复合体启动。双链cDNA用Klenow片段钝化，然后被连接到接着用T4多聚核苷酸激酶磷酸化过的EcoRI衔接子上。在聚丙烯酰胺葡聚糖S-400柱上纯化过的100ngXhoI消化的cDNA，被连接到1μg Uni-ZAPXR载体臂的XhoI-EcoRI

多克隆位点上，然后该产物用Gigapack II包装抽提试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)包装。在XL1-Blue MRF’细胞中扩增初始文库，使滴度达到1.4×10噬菌斑形成单位/ml。

与预测 hCTGF初始翻译产物的3′末端相应的已证实的P标记CTGF探针，通过RNA的逆转录酶-聚合酶链式反应从人包皮成纤维细胞中获得，所用的正向和反向引物分别是

5′-GCCGTCTAGAGCGGCCGCATGGAAGAGAACATTAAGAAGGG-3′(SEQ ID

NO：3)and 3′-CCTCTGTACCGTACTTAAGCGCCGGCGACC-5′(SEQ ID NO：4)，用该探针筛选10

个噬菌斑，其中2个显示可重复的杂交，然后用快速切

割试剂盒(Strafagene)分离。获得2个～5.0千碱基对pBluescripf SK猪CTGF克隆，称为pBSK-pBSK-pCTGF1和pBSK-p-pCTGF2，

用于初始的测序反应。然后由手工和自动的双脱氧终止测序法(Sanger，F，等，美国国家科学院院报74，63-67(1977))相结合，完全测定pBSK-pCTGF1的序列。序列资料从2条键的DNA中获得。表2列出了HBGF-0.8-P1和-P2的序列。

确定克隆猪CTGF cDNA为1.51千碱基对，具有1,047碱基对的开放读框。预测pCTGF的初始翻译产物包括349个氨基酸并含有残基247和262之间的HBGF肽-0.8序列(表2)。在氨基酸水平，pCTGF与fisp-12和hCTGF大约～92％一致。切除其假定的26个残基信号肽后，预测pCTGF包括323个氨基酸并含有在hCTGF和fisp-12中完全保守

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的38个Cys残基。

实施例3 HBGF抗体的产生

由于HBGFs表示截短的CTGF的微异源形式，研究HBGF与CTGF的关系。用和HPLC纯化的HBGF多肽起反应的CTGF抗体，对未分级纯化的ULF蛋白印迹，确认在起始材料中10-kD的蛋白的存在。为产生抗体，在Synergy 432A肽合成仪(应用生物系统公司)上产生含有序列EENIKKCIRIP(残基247-260(SEQ ID NO：5)的4分枝多抗原CTGF-(247-260)肽，然后用C18柱(0.46×36cm；Rainin仪器公司)经反相HPLC纯化、该柱子用5-95％在水中的乙腈

梯度，0.1％三氟乙酸显现90min。合并含有纯化多肽的级分，蒸发至干燥并在无菌水中重新制成溶液。被抽血收集前免疫血清的2只新西兰白兔(兔A和B)皮下注射在弗氏完全佐剂中的1mg多肽，3周后肌肉内注射在弗氏不完全佐剂中的250μg的多肽。7天后从动物中取血收集抗血清。抗血清的反应性经蛋白印迹和免疫沉淀证实有效。来自A兔的前免疫血清和抗血清用在这些实验中。实施例4 10-kDa HBGF多肽的产生

按以前所描述的方法(Harlow和Lane，1988，抗体，实验室手册，冷泉港实验室，纽约现时版)，进行蛋白印迹。简言之，按所述的方法(Kim，G.Y.等，生物生殖杂志52，561-571(1995))，用18％聚丙烯酰胺微型凝胶在还原条件下进行SDS-PAGE。按所述方法(Wray，W等，分析生物化学118，197-203(1981))进行蛋白的银染色。在(i)HPLC纯化的生长因子，(ii)8μl未分级纯化的ULF，或(iii)经存在于10mMTris-HCl，0.5M NaCl(pH7.4)的肝素-葡聚糖20μl床过滤然后用SDS-PAGE样品缓冲液抽提肝素珠处理过的100μl ULF中，进行蛋白

印迹。接所述的方法(Kim，G.Y.等，生物生殖杂志52，561-571(1995))，凝胶被印迹，然后封闭，并用1∶1,000稀释的兔前免疫血清或1∶1,000稀释的兔抗pCTGF-(247-260)肽抗血清(兔A)温肓。用连接碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG，然后用氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚

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磷酸生色底物显现免疫反应带。

除了10-kDa蛋白，2种另外质量形式的CTGF(16和20-kDa)也存在ULF中，但未获得足够的证据表明存在38-kDa CTGF。蛋白印迹进一步证实HPLC纯化的HBGF包括单一的免疫反应10-kDa蛋白。比较来自确定体积未稀释的子宫液(即0.7-2.3ml)的HBGF染色强度和纯化的HGBF促原量的染色强度，表明HBGFs促有丝原浓度存在于体内子宫液中。总之，表明ULF不含有可检测水平的38-kDa CTGF但含有其量可能为促原的HBGFs的资料表明HBGFs在体内天然产生，并不是它们纯化过程中38kDa CTGF的降解结果。实施例5 HBGF多肽的肝素结合特性

与HBGF-0.8-P2相比较，HBGF多肽-0.8-P1的N-末端

存在额外的一个酸性Glu残基与该分子的较低肝素亲和性有关，这表明HBGF肽-0.8的N-末端可能是结合肝素结构域的部分。为了测定CTGF分子的N-末端区以及其他部分的结合肝素特性，研究了包括整个hCTGF的C-末端103个残基的18个多肽结合[H]肝素的能力。合成了包括整个CTGF的103个C-末端残基的18个合成多肽，并用来自Chiron Mimotopes(Clayton，Victoria，澳大利亚)的切割PepSet处理。除了用游离N-末端氨基合成CTGF-(247-255)和CTGF-(247-260)和用酸性C-末端合成CTGF-(326-349)及CTGF-(339-349)外，所有的多肽用乙酰化N-末端和酰胺化C-末端合成(表3)。

所有多肽含有一个或不含有Cys残基，在CTGF(285-292)中的Cys

292TM

和在CTGF-(3 18-328)中的Cys

287

325

用Ser取代，以防止各

个多肽之间与Cys或Cys

323

形成链内二硫键。采用改进的Baird等的方

法(Baird，A.等，美国国家科学院院报85，2324-2328(1988))，

确定结合肝素的特性。简言之，将每种多肽37.5nmol用点印迹设备重复二次吸附到纤维素膜上。印迹膜用10mM Tris-HCl，0.15MNaCl，0.1％牛血清白蛋白(pH7.4)封闭30分，然后室温下在含10μCi/ml[H]肝素(NEN生命科学产物公司)的该溶液中温育3hr。印迹膜用10mM Tris-HCl，0.15M NaCl清洗4次，然后各个印迹点和

98809911.X液闪液混合以进行[3

H]的计数。

表3总结了用这些合成多肽获得的结果。结合肝素的最高水平是从含有残基247-260、274-286和305-328的多肽得到。应该注意这些多肽没有一个在3T3细胞DNA合成测定中具有HBGF多肽激动剂或拮抗剂活性。

表3 肽结构域序列

(平均值±S.D.) cpm/μg无 11±0.2CTGF-(247-255) EENIKKGKKa

10±0.3CTGF-(247-260) EENIKKGKKCIRTPa

836±1CTGF-(257-272) IRTPKISKPIKFELSG 70±13CTGF-(259-275) TPKISKPIKFELSGCTS 124±3CTGF-(274-283) TSMKTYRAKF 388±12CTGF-(274-286) TSMKTYRAKFCGV 1108±119CTGF-(285-291) GVCTDGR 7±0.3Ser

292

CTGF-(285-292) GVCTDGRS 8±0.4

CTGF-(293-306) CTPHRTTTLPVEFK 9±1.1CTGF-(294-306) TPHRTTTLPVEFK 11±0.4CTGF-(305-322) FKCPDGEVMKKNMMFIKT 237±22CTGF-(308-322) PDGEVMKKNMMFIKT 71±2CTGF-(318-324) MFIKTCA 475±116Ser

125

CTGF-(318-328) MFIKTCASHYN 601±40

CTGF-(324-328) ACHYN 9±1CTGF-(326-349) HYNCPGDNDIFESLYYRKMYGDMAb

10±1CTGF-(330-340) PGDNDIFESLY 10±0.5CTGF-(339-349) LYYRKMYGDMAb

9±0.5

a游离N-末端氨基b

酸性C末端

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结合肝素的[3

H]量 98809911.X说明书第24/26页

上述的研究显示肝素调节受体结合和包括bFGF、HB-EGF和双调蛋白等几种HBGF多肽的生物学活性(Besner，G.E.等.，生长因子7，2-296(1992)；Higashiyama，S.等，细胞生物学杂志122，933-940(1993)；Rapraeger，A.C.等，科学252，1705-1708(1991)；Olwin，B.B.等，细胞生物学杂志118，631-639(1992)；Cook，P.等，细胞生理学杂志163，418-429(1995)；Yayon，A.等，细胞，841-848(1991)；Aviezer，D.等，美国国家科学院院报91，12173-12177(1994))。由于HBGF肽-0.8表现为强肝素亲和性，我们检查了该糖胺聚糖对HBGF肽-0.8促原活性的影响。高刺激剂量的HBGF肽-0.8的活性被1-3μg/ml肝素明显增强但被30-100μg/ml肝素所抑制。相同的肝素剂量对3T3细胞中基础或小牛血清刺激的DNA合成没有影响。

实施例6 HBGF促原性测定

为评估HBGFs与IGF-I、EGF、bFGF和PDGF-AB的相对促有丝活性，在3T3细胞中进行DNA合成测定(表4)。合并来自Bio-Rex柱含有0.3-0.6M NaCl洗脱液的生物学活性级分，用含有0.1％ CHAPS的20mM Tris-HCl(pH7.4)稀释3倍，经0.45μm膜

滤器过滤，放在聚丙烯管中，然后用蠕动泵以2ml/min加到EconoPac肝素柱(0.7×3.6cm；Bio-Rad)上。然后用50ml 20mM Tris-HCl缓冲液，0.2M NaCl、0.1％CHAPS冲洗涤该肝素柱，用快速蛋白液相层析(FPLC)系统(Pharmacia Biothch Inc)，用在20mM

Tris-HCl，0.1％CHAPS(pH7.4)的40μl 0.1-20M NaCl梯度，以1ml/min显示。在NaCl梯度抽提过程中收集级分(1ml)到硅化的离心管中，然后测定3T3细胞促有丝活性。

按所述的方法(Kim，G.Y.等，生物生殖杂志52，561-571(1995))，通过测定[H]胸腺嘧啶掺入到汇合静止的Balb/c 3T3细胞的DNA中，检测柱级分刺激DNA合成的能力，Balb/c 3T3细胞生长在200μl含10

％小牛血清的Dulbecco′s修饰Eagle′s培养基的96孔培养板中。重复三次测定每个剂量确立对来自ULF的纯化生长因子的剂量反应曲线，以平

均数±S.D.计算数据。通过学生t检验确定1～100μg/ml猪肝素(sigma)

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对生长因子活性影响的统计学显著性。

由HBGF肽引起的[H]胸腺嘧啶掺入值可和小牛血清或纯化的PDGF

或bFGF的值，而非较弱促有丝原如IGF或EGF的值相比较。此外，

发现HBGFs的3T3促有丝和生物学活性由10ng/ml IGF-I、

10ng/ml PDGF、3ng/ml EGF或0.3ng/ml bFGF所协同增强。

用Balb/c 3T3细胞、牛毛细管内皮细胞(BCECs)和血管平滑肌

细胞研究靶细胞的特异性。按上面所述的方法使用3T3细胞。BCECs从

J.Folkman博士(儿童医院，波斯顿，MA，获得，用含有3ng/ml bFGF

和10％热失活的小牛血清的Dulbecco′s修饰Eagle′s培养基，培养在涂

有胶原的培养瓶中。用已建立的方法(Weich，H.A等，生长因子2，

313-320(1990)，从2-3cm长的猪胸腔主动脉中分离平滑肌细胞，

用10％Dulbecco′s修饰Eagle′s培养基、10％胎牛血清培养该细胞。基

本上按所述的方法(Besner，G.E.Higashiyama，S和Kagsbrun，M.细胞调

控1，811-819(1990))，在48-或96-孔板中进行BCEC和平

滑肌细胞DNA合成的测定。BCEC DNA合成测定也在10μg/ml猪肝

素存在下进行。发现HGBF对平滑肌细胞具有促有丝活性，并产生

超过EGF最大量，但低于bFGF量的刺激水平。当单独或100μg肝素存

在下测定时，HBGFs对内皮细胞缺乏促有丝活性(见表4)。

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表4

细胞类型处理 [H]胸腺嘧啶掺入 (平均数±S.D.) Cpm/wellBalb/c 3T3成纤维细胞空白 428±18 20％小牛血清 123,820±7,470 30ng/ml IGF-1 4,412±170 30ng/ml EGF 11,550±101 10ng/ml bFGF 73,853±3,122 30ng/ml PDGF-AB 110,110±7.077 20μl/ml HBGF-0.8 114,730±3,200 血管平滑肌细胞空白 680±341

3ng/ml EGF 1,343±378 3ng/ml bFGF 3,082±374 15μl/ml HBGF-0.8 1,709±403 毛细血管内皮细胞空白 316±84 100μg/ml肝素 240±52

3ng/ml bFGF 2,865±276 3ng/ml bFGF+100μg/ml肝素 1,840±4 3ng/ml aFGF 603±46

3ng/ml aFGF+100μg/ml肝素 2,232±236 20μl/ml HBGF-0.8 243±4 20μl/ml HBGF-0.8+100μg/ml 195±12 肝素

尽管参考目前优选的具体实施方案，应当明白在不偏离本发明实质的情况下能进行各种修改。因此，本发明仅由下列权利要求书所限定。

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说明书附图

第1/4页

98809911.X说明书附图第2/4页

图2

98809911.X说明书附图第3/4页

图3b

图4

98809911.X说明书附图第4/4页

图5

图6

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