实验一 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学测定
一、实验目的
通过实验了解和掌握蔬菜中农药残留量的生物化学测定的原理和方法，比较两种常见的生物化学测定法，即速测卡法和酶抑制率法的异同。
二、实验原理
生物化学测定方法根据其检测手段又可分为速测卡法和酶抑制率法（分光光度法）。速测卡法的测定原理是根据胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药。
酶抑制率法的原理是在一定条件下，有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱在显色剂的作用下产生黄色物质，该黄色在412nm处有特征吸收峰，用可见分光光度计或农药残毒快速检测仪进行测定。
三、试剂及仪器
1、仪器
常用天平、农药残毒快速检测仪、台式恒温培养箱、微型混合器。 2、试剂
农残速测卡：固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片；
pH8.0缓冲溶液：取11.9mg无水磷酸氢二钾与3.2mg磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解；
显色剂：取160mg二硫代二硝基苯酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，在4℃冰箱中保存；
底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱8.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4℃冰箱中保存，保存期不超过一周；
乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，但吸光度值应控制在0.3以上。 可选用以上试剂制备的试剂盒（含缓冲液、显色剂、底物、乙酰胆碱酯酶，不同厂家生产的试剂盒具体试验操作不完全相同）。
四、测定步骤
1、速测卡法（纸片法）
① 滴2~3滴洗脱液在菜叶正面近叶尖部分，用另一片菜叶滴液处轻轻摩擦。
② 取一片速测卡，将菜叶上洗出的水滴1滴在白色药片上，静置10min，保持药片润湿。 ③ 将速测卡对折，用手捏3min。
④ 打开速测卡，白色药片变蓝色为正常反应，不变蓝或显淡蓝色说明有过量有机磷或氨基
甲酸酯类农药残留。每批同时做一片无农药对照。 2、酶抑制率法
① 取2g切碎样本，置于提取瓶内，加入20mL提取试剂，震荡1~2min；倒出上清液，静
置3~5min。于平底小试管中加入100μL酶液、3mL样品提取液、100μL显色剂，在37~38℃下培养15min。
② 于待测的小试管内加入100μL底物，倒入比色杯内，进行仪器测定。同时做对照组试验。
（注：不同试剂盒的添加量不完全相同，具体按说明书操作。）
五、结果计算和判定
1、速测卡法
速测卡检测结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（阳性）和未抑制（阴性）来表示。强阳性结果：速测卡白色药片不变色，说明农药残留量高；弱阳性结果：速测卡白色药片显浅蓝色，说明农药残留量相对较低；阴性结果：速测卡白色药片显天蓝色或与空白对照卡相同。
表1-1所示为速测卡法对我国常见使用的一些有机磷和氨基甲酸酯类农药的最低检出限。
表1-1 速测卡对几种农药的最低检测限（mg/kg） 农 药 甲胺磷 敌敌畏 氧化乐果 乐果 敌百虫 检测限 1.7 0.3 2.3 1.3 0.5 农 药 乙酰甲胺磷 丁硫克百威 马拉硫磷 水胺硫磷 对硫磷 检测限 3.5 1.0 2.0 3.1 1.7 农 药 甲萘威（西维因） 克百威（呋喃丹） 久效磷 检测限 2.5 0.1 2.5 使用速测卡法检出蔬菜样品为农药阳性时，需用气相色谱或质谱法对阳性试样进行进一步的实验来确定是哪种农药以及其确切含量。 2、酶抑制率法
抑制率ΔAcΔAt100%
ΔAc式中：ΔAc——对照管溶液反应3 min吸光度的变化值；
ΔAt——样品管溶液反应3 min吸光度的变化值。
当样品提取液对酶的抑制率＜50%时，表示样品农药残留检测合格；若抑制率≥50%，表示样品中可能含有高浓度的有机磷或氨基甲酸酯类农药，则实验需要重复两次以上。
表1-2所示为酶抑制率法对部分农药的最低检测限。
表1-2 分光光度法对几种农药的最低检测限（mg/kg）
农 药 甲胺磷 敌敌畏 氧化乐果 乐果 检测限 1.5 0.01 0.8 1.0 农 药 甲基异硫磷 克百威 马拉硫磷 辛硫磷 检测限 5.0 0.002 4.0 0.3 农 药 灭多威 敌百虫 对硫磷 检测限 0.1 0.2 0.1 六、注意事项 1、速测卡法检测中，当温度低于37℃时，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长。延长时间的确定，应以空白对照卡用手指捏3min时可以变蓝色为准，且样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。 2、速测卡法检测中，预反应后药片表面必须保持润湿。
3、采用酶抑制率法测定韭菜、生姜、葱、蒜、辣椒、胡萝卜等蔬菜中的农药残留时，不要剪得太碎，浸提时间不能太长，因为这类蔬菜含有较多可使酶失活的成分，易产生假阳性。对于这类蔬菜必要时可采取整株浸提。一些叶绿素含量较高的蔬菜也是如此。 4、 当温度低于37℃时，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应适当延长，延长时间的确定
应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化值在0.3以上，即可往下操作。且样品放
置时间应与空白对照溶液放置的时间一致。
5、 当吸光度过大无法读取时，说明测定溶液浑浊有干扰。
七、思考题
1、影响速测卡法和酶抑制率法测定农药残留量准确性的因素有哪些？如何减少其影响？ 2、比较速测卡法和酶抑制率法的异同。
3、简述各种农药残留量的快速检测方法在实践中的应用。
实验二 对虾中氯霉素含量的酶联免疫吸附试验法检测
一、实验目的
进一步学习酶联免疫试验法的基本原理和实验方法，确实掌握酶联免疫吸附试验法测定虾肉中氯霉素含量的基本原理、实验方法和结果的分析和判定。
二、实验原理
抗原与抗体能发生特异性的免疫化学反应。以竞争性酶联免疫反应为例：酶标记抗原与样品或标准品中的非标记抗原（氯霉素）具有相同的与抗体结合的能力，两者竞争与固相载体包被的抗体结合反应。洗涤多余的酶标抗原，加酶反应的底物后，底物被酶催化显色，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。在整个反应中，样品中氯霉素含量越多，反应显色就越淡。反之，样品中氯霉素含量越少，则显色越深。
三、仪器与试剂
1、仪器
酶标分析仪。 2、试剂
氯霉素检测用试剂盒：包括微量测试孔（每条8孔，每板12条）；氯霉素标准溶液（六个浓度0ppb、0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.6ppb，不同试剂盒浓度可能不同）；10倍浓缩萃取稀释液；10倍浓缩洗涤液；氯霉素酶标记物；底物溶液；反应终止液。
说明：此试剂盒检测范围广，可用于鸡肉、鱼、虾、蟹、牛奶、血清、肌肉、组织、饲料与蜂蜜等的氯霉素含量的检测，回收率为80%～120%，灵敏度可达到0.05ppb。（不同试剂盒的具体参数不完全相同）
图2-1 氯霉素检测试剂盒
1
四、实验步骤
1、实验准备
① 从冰箱取出试剂盒，将氯霉素标准溶液、浓缩萃取稀释液、浓缩洗涤液、酶标记物、底
物溶液及微量测试孔条置于室温下回温30min。 ② 配制原倍萃取稀释液及洗涤液：用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液分别用蒸
馏水按1:9的比例稀释。 2、样品制备
① 将3g对虾肉剪碎后放入50mL带塞离心管（底部）中，加入6mL乙酸乙酯，用均质机
均质约1min，再震荡约30s。 ② 离心（3000rpm，10min），取2mL上清液至玻璃管中，于50℃下氮气吹干。 ③ 于上述玻璃管中加入正己烷2mL，先将残余物完全溶解后，再加入1mL原倍萃取稀释液，
震荡约30s。
④ 离心（3000rpm，10min），用吸管吸去上层液及中间乳化层部分，弃掉，取下层液备用。 ⑤ 若乳化现象较严重，则先将大部分上层液取出后，再将玻璃管置入80℃水中，隔水加热
约5～10min，可改善乳化情形。 3、操作步骤
① 取一定的微量测试孔条，于适当微孔中分别加入100μL标准溶液（六个浓度）。 ② 在另外的微孔中加入100μL已完成前处理的样品溶液。 ③ 在每一微孔中加入50μL酶标记物。
④ 轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育1h。
⑤ 甩掉微孔中的反应液，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次。 ⑥ 最后一次甩掉洗液后，在吸水纸上拍干。
⑦ 于每一微孔中加入底物溶液100μL后，轻敲盘子四周，使其充分混合。 ⑧ 于室温下避光静置温育20min。
⑨ 于每一微孔中加入100μL反应终止液，用酶标仪于波长450nm下判读。
五、结果处理
1、所测得的标准吸光值和样品吸光值（B）除以第一个标准（零标准）的吸光值（B0）再乘
以100。
2、以B/B0的百分数值为纵坐标，以标样浓度（ppb）为横坐标，绘制标准半对数曲线（如图2）。
3、根据每个样品的B/B0的百分数值就可从曲线上读出相对应样品的浓度（ppb）。
4、根据标准曲线所得出的样品浓度和样品处理过程中的稀释倍数，计算出样品中氯霉素的
实际浓度，最后的结果用“μg/kg”单位表示。
图2-2 ELISA法检测氯霉素含量的标准半对数曲线示意图
2
六、注意事项
1、使用前先将氯霉素各标准溶液，浓缩萃取稀释液，浓缩洗涤液，酶标记物，底物溶液及
微量测试孔条置于室温下，回温30min。回温后，取出所需微量测试孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好，置于4℃保存。 2、浓缩萃取稀释液和浓缩洗涤液使用前必须稀释。
3、试剂盒较贵且量很少，请准确量取，不要造成浪费，且每次吸取不同的液体时一定要换
移液枪的吸头。
4、加样时必须小心勿溅出微孔外，以免造成其他微孔的污染，加样品或试剂时枪头请勿接
触微孔。
5、洗涤必须充分，重复3次，注意加洗涤水的移液器枪头尖必须置于微孔板上板面约0.5cm
处打出洗涤水，绝对避免注入板孔中的液体接触到或溅到移液器管尖上而将孔中的物质带回洗涤用水中。
6、温育时，要盖上塑料片或标签纸，置于暗处，温育时间不够不要随意取出。 七、思考题
1、简述酶标仪的工作原理。
2、影响酶联免疫吸附试验法检测虾中氯霉素含量准确性的因素可能有哪些？ 3、本实验中，为什么样品中氯霉素的含量与显色呈反比？ 4、如果洗涤不彻底会给实验结果造成怎样的影响？为什么？ 5、阐述氯霉素检测过程中标准曲线线性不好的原因。
3
实验三 鱼体中组胺含量的分光光度法检测
一、实验目的
通过实验进一步学习并掌握分光光度法检测鱼肉中组胺含量的实验原理和实验方法；培养学生分析和解决问题的能力。
二、实验原理
鱼体中的组胺用正戊醇提取后，与偶氮试剂反应显橙色，与标准系列比较定量。最低检出浓度为5mg/100g。
三、仪器与试剂
1、材料 马鲛鱼。 2、仪器
722s分光光度计。 3、试剂
碳酸钠、氢氧化钠、对硝基苯胺、亚硝酸钠、正戊醇、三氯乙酸、盐酸、组胺标准品，均为分析纯试剂。
四、实验步骤
1、组胺标准曲线的制作
偶氮试剂的配制：
甲液：取0.5g对硝基苯胺，加5mL盐酸溶解后，用水定容至200mL，冰箱内保存。 乙液：0.5%亚硝酸钠溶液，临用前现配。
取甲液5mL，乙液40mL混匀后，成偶氮试剂，临配现用。
组胺标准溶液的配制：取0.2767g于105℃干燥至恒重的磷酸组胺，定容至100mL，制成lmg/mL的组胺标准液。再用水稀释50倍成40μg/mL的组胺标准使用液。 2、样品中组胺的提取
取10g切碎的鱼肉置于具塞锥形瓶中，加入20mL三氯乙酸（100g/L），60℃水浴中浸泡30min（不时振摇），过滤。取2.0mL滤液于分液漏斗中，加氢氧化钠溶液（250g/L）使其呈碱性（pH 9～10）。加入3mL正戊醇，充分振摇5min，静置分离，取正戊醇提取液。重复萃取三次，合并三次的正戊醇提取液并用正戊醇定容至10.0mL。吸取2.0mL正戊醇提取液于分液漏斗中，用盐酸（1+11）振摇提取3次，合并盐酸提取液并定容至10.0mL，备用。 3、样品中组胺的测定
取1.0mL盐酸提取液于10mL比色管中，加水至2mL；同时取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL组胺标准使用液分别置于10mL比色管中，加水到1mL，再各加1mL盐酸（1+11）；标准管与样品管各加3mL碳酸钠溶液（50g/L），3mL偶氮试剂，加水至10.0mL，混匀，放置10min后以零管调节零点，于480nm处测比色测定，并绘制标准曲线。
五、结果计算
根据标准曲线、样品吸光度值和样品稀释倍数计算原料中组胺含量，结果用g/100g表示，与相应的标准进行比较分析。
六、注意问题
1、偶氮试剂必须临配现用。
2、用正戊醇提取三氯乙酸溶液中的组胺时，必须用氢氧化钠调节溶液pH值至碱性，使组
胺游离便于提取；而在用盐酸（1+11）提取时则必须使溶液呈酸性，使组胺能成为盐酸
4
盐而溶于盐酸提取液中。
3、组胺测定过程中，标准管和测定各管的条件必须控制一致，保证显色反应的稳定性和一
致性。
4、组胺与偶氮试剂的反应须在弱碱性条件下进行，且反应时间控制10min。
七、思考题
1、影响组胺含量测定准确性的因素有哪些？
2、组胺与偶氮试剂的反应中，酸碱度控制不当会给实验结果造成怎样的影响？ 3、组胺的检测方法除分光光度法之外还有哪些，试述其检测原理。
5
实验四 饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的高效
液相色谱法测定
一、实验目的
通过实验学习并掌握高效液相色谱同时检测饮料、果冻等食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的实验原理和实验方法；培养学生动手能力和分析解决问题的能力。
二、实验原理
不同样品经提取后，将提取液过滤，经反相高效液相色谱分测定，根据保留时间定性，外标峰面积定量。
三、试剂及仪器
1、仪器
高效液相色谱仪（配有紫外检测器）、离心机（转速不低于4000r/min）、超声波清洗器、食品粉碎机、旋涡混合器、pH计、天平等。 2、试剂
⑴ 甲醇：色谱纯。
⑵ ：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤。 ⑶ 亚铁氰化钾溶液：称取106g亚铁氰化钾 [K4(CN)6·3H2O]加水至1000mL。
⑷ 乙酸锌溶液：称取220g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1000 mL。
⑸ 氨水（1+1）：氨水与谁等体积混合。
⑹ 苯甲酸标准储备液：准确称取0.2360 g苯甲酸钠，加水溶解并定容至200mL。此溶液每毫升相当于含苯甲酸1.00mg。
⑺ 山梨酸标准储备溶液：准确称取0.2680g山梨酸钾，加水溶解并定容至200mL。此溶液每毫升相当于含山梨酸1.00mg。
⑻ 糖精钠标准储备溶液：准确称取0.1702g经120 ℃烘干4 h的糖精钠，加水溶解并定容至200 mL。此溶液中糖精钠的含量为1.00mg/mL。
⑼ 混合标准使用液：分别准确吸取不同体积苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准储备溶液，将其稀释成苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量分别为0.000 mg/mL、0.020 mg/mL、0.040 mg/mL、0.080 mg/mL、0.160 mg/mL、0.320 mg/mL的混合标准使用液。经0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。
四、测定步骤
1. 样品的制备
（1）碳酸饮料: 称取10.00g样品，放入小烧杯中，水浴加热搅拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）调pH约至近中性后移入25mL容量瓶中，用水定容至刻度，经0.45 μm滤膜过滤，滤液待上机分析。
（2）果汁饮料：称取10.00 g样品，放入小烧杯中，用氨水（1+1）调pH约至近中性后移入25mL容量瓶中，用水定容至刻度，经0.45 μm滤膜过滤，滤液待上机分析。
（3）乳饮料、植物蛋白饮料：称取10.00 g样品于25mL容量瓶中，加入2mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2mL乙酸锌溶液摇匀，以沉淀蛋白质，加水定容至刻度，4000r/min离心10min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液待上机分析。 2.上机前的准备工作 （1）将经过0.45 µm滤膜抽滤的流动相于超声波清洗器脱气10~20min。
6
（2）柱子的更换 ① 换柱前，先确认仪器上现有的色谱柱已经冲洗干净，且柱内流动相适合保存色谱柱。一般反相柱保存在甲醇中。 ② 停泵，请在泵压力表变为0时进行拆卸。拆下的旧柱，柱两端要用封口螺丝拧好保存。 ③ 在接新柱前，一定要保证新柱所用的流动相与仪器系统中原有的流动相互溶。安装时注意柱子的流向（柱子上有箭头，箭头所指方向接检测器），不能接反。出口端先不接检测器，设定一个小流速，估计柱内保存液基本流出色谱柱，且柱压基本稳定后再接上检测器。连接管线的接头螺丝一定要拧紧，不能漏液，但不能用力过猛。 ④ 参照仪器使用说明开机，按“purge”键排空流路中的气泡。设置实验参数，启动色谱系统，先用10%甲醇溶液冲洗系统30min，然后用流动相（甲醇+乙酸铵溶液（5+95））冲洗系统30～60min，待基线信号平稳后，即可进样分析。 ⑤装柱时要注意不要将色谱柱掉落或猛烈碰撞，强烈的撞击会引起峰变形。
2. 色谱条件
（1）色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm或150mm×4.6mm,5μm。 （2）流动相：甲醇+乙酸铵溶液（5+95）。 （3）流速：1mL/min。 （4）检测波长：230nm。 （5）进样量：10μL。 3. 测定
取样品制备液和混合标准使用液各10μL注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间为依据定性，以其峰面积求出样液中被测物质含量，供计算（苯甲酸、山梨酸和糖精钠同时测定的谱图参见下图）。
图4-1 苯甲酸、山梨酸和糖精钠高效液相色谱图
全部样品分析完后，用10%甲醇溶液冲洗流路和进样口，然后再用70%甲醇溶液清洗系统后按程序关机。 五、结果计算
样品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量按4.1计算：
X=cV1000 （4.1）
m1000式中：
X ——样品中待测组分含量，g/kg；
c ——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，mg/mL； V ——样品定容体积，mL； m ——样品质量，g。
7
实验五 饮料中食用合成着色剂的测定
（设计性实验） 计划学时：8学时
一、实验目的
通过本实验，要求学生熟悉在食品安全性检验过程中，综合运用所学理论知识进行实验设计的总体原则和基本方法；掌握薄层色谱—分光光度法分离和测定合成着色剂的基本原理和实验方法；进一步了解我国食品添加剂使用标准对食用合成着色剂的规定以及我国饮料中添加剂的使用情况；培养学生的实验设计能力、独立分析和解决问题的能力以及综合运用知识的能力。
二、实验内容
学生自主选择市售的各种饮料，根据所学的基础理论知识，结合现有的实验条件，通过查阅相关文献资料，设计简易可行的实验方案，对饮料中苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄及亮蓝5种食用合成着色剂进行提取、分离以及定性和定量检测。根据我国食品添加剂使用卫生标准，对市售饮料中合成着色剂的使用情况进行评价和比较。
三、实验要求
本实验要求学生有目的地选择市售饮料（每组至少选择2种，每班至少选择15种），根据所选饮料的性质和实验项目要求独立设计实验、准备和完成实验并对实验结果进行分析和讨论；每组提供完整的实验报告一份，综合各组的实验结果，每班拟写一份湛江市售饮料中合成着色剂使用情况的调查报告。
四、实验仪器设备和材料清单
1、实验材料 市售饮料。 2、实验试剂
苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄和亮蓝标准着色剂；柠檬酸；柠檬酸钠；聚酰胺粉（化学纯和薄层层析用两种）；可溶性淀粉；硅胶G；甲醇；甲酸；乙二胺；乙醇；氨水。 3、实验仪器
恒温水浴锅；砂芯漏斗；可见分光光度计；展开槽；微量注射器；薄层板；电子天平；常用玻璃仪器等。
五、实验步骤
（独立设计简易可行的实验方案，列出具体实验步骤，做好实验准备，必要的要进行预备实验，亦可参考以下实验过程） 1、样品处理 2、吸附分离
一定条件下用聚酰胺粉使色素完全吸附。将吸附了色素的聚酰胺粉全部转入漏斗中过滤，洗涤，然后在一定条件下解吸。
如果着色剂为单色，则可直接用分光光度法测定；如果为多种着色剂的混合液，则用薄层色谱法分离后进行定性和定量检测。 3、薄层色谱分离和定性检测
（1）薄层板的制备和活化。
（2）点样：在制备好的薄层板上点上样品溶液和着色剂标准溶液。
8
（3）展开：对不同着色剂选择不同的展开剂体系使之展开和分离。 4、测定
（1）样品测定。
（2）标准曲线的绘制。 5、结果计算和讨论
通过与标准比较进行定量。综合定性和定量检测的结果，根据添加剂使用卫生标准对湛江市售饮料中合成着色剂使用的安全性进行评价和比较。
六、思考题
1、提取分离食用合成着色剂的基本原理是什么？
2、样品前处理过程中吸附色素除了聚酰胺粉还有哪些材料可用？ 3、薄层色谱法分离检测合成着色剂的基本原理是什么？
4、影响薄层色谱—分光光度法检测食用合成着色剂含量的因素主要有哪些？如何降低其影响？
5、食用合成着色剂混合物的分离方法除薄层色谱法之外还有哪些？试简述其基本原理。
七、考核形式
采用实验前提问、实验过程监测（本实验必须有检测结果）和书面报告检查的方式进行综合考核，主要考核学生对理论知识应用的能力、独立分析解决问题的能力、实验方案的可行性和完整性、实验操作能力和实验报告的质量等。
八、实验报告要求
实验结束后提交完整的实验设计报告。要求报告符合规范，数据处理合理，图表清晰，对结果进行详细的讨论和分析。每个班对各组的实验结果进行综合，拟写一份湛江饮料中合成着色剂使用情况的调查报告。
9
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容