牛膝多糖在抗结直肠癌中的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1102698 A(43)申请公布日 2019.09.24

(21)申请号 201810211374.6(22)申请日 2018.03.14

(71)申请人 上海中科多泰生物科技有限公司

地址 200135 上海市浦东新区中国（上海）

自由贸易试验区浦东大道2123号三楼西南区(72)发明人 黄伟达　杨义力　吴晓琰　(74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限

公司 31266

代理人 肖艳　徐迅(51)Int.Cl.

A61K 31/715(2006.01)A61P 35/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图2页

()发明名称

牛膝多糖在抗结直肠癌中的应用

(57)摘要

本发明涉及牛膝多糖在抗结直肠癌中的应用。具体地，牛膝多糖可以用于制备选自下组细胞因子的促进剂：Bmp3、Csf2、Ifnb1、Il15、Il17c、Il17f、Il2、Il23a、Il5、Inhba、Adipoq、Csf3、Il10、Il24、Il6、Inha、或其组合。牛膝多糖还可以用于制备选自下组细胞因子的抑制剂：Cd40lg、Il10、Il13、Il16、Il1b、Lta、Ltb、Tnf、Tnfsf8、Il23a、Spp1、或其组合。牛膝多糖在小鼠结直肠癌模型，能够治疗和/或预防肿瘤；牛膝多糖在正常小鼠似乎有轻度免疫刺激作用；牛膝多糖在结直肠癌模型小鼠的肿瘤预防作用可能是由通过抑制IL23和肠炎的发生。CN 1102698 ACN 1102698 A

权　利　要　求　书

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1.一种牛膝多糖的用途，其特征在于，用于制备细胞因子的促进剂,或用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于促进或上调细胞中的细胞因子表达，

其中，所述的细胞因子选自下组：Bmp3、Csf2、Ifnb1、Il15、Il17c、Il17f、Il2、Il23a、Il5、Inhba、Adipoq、Csf3、Il10、Il24、Il6、Inha、或其组合。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细胞因子来自肠细胞。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的细胞包括正常细胞；和/或所述细胞因子选自下组：Bmp3、Csf2、Ifnb1、Il15、Il17c、Il17f、Il2、Il23a、Il5、Inhba、或其组合。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细胞包括癌细胞；和/或所述细胞因子选自下组：Adipoq、Csf3、Il10、Il24、Il5、Il6、Inha、或其组合。5.一种牛膝多糖的用途，其特征在于，用于制备细胞因子的抑制剂，或用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于抑制或下调细胞中的细胞因子表达，

其中，所述的细胞因子选自下组：Cd40lg、Il10、Il13、Il16、Il1b、Lta、Ltb、Tnf、Tnfsf8、Il23a、Spp1、或其组合。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述细胞因子来自肠细胞。7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述细胞包括正常细胞；和/或所述细胞因子选自下组：Cd40lg、Il10、Il13、Il16、Il1b、Lta、Ltb、Tnf、Tnfsf8、或其组合。

8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述细胞包括癌细胞；和/或所述细胞因子选自下组：Il13、Il23a、Spp1、或其组合。9.一种牛膝多糖的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症的药物组合物或制剂。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症为结直肠癌，较佳地为炎症性结直肠癌。

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牛膝多糖在抗结直肠癌中的应用

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技术领域

[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及牛膝多糖在抗结直肠癌中的应用。

背景技术

[0002]牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharides,ABPS)是中药牛膝根中的生物活性多糖。实验和临床研究表明，它具有增强肿瘤患者对抗肿瘤治疗的耐受、调节免疫、延缓衰老、降血糖和通络活血等药理功能。ABPS成分均一，由果糖：葡萄糖(8：1)组成，其分子量为1400D，并且其化学结构已经被鉴定出来。有文献报道，ABPS刺激DC能协同CIK提高对人结直肠癌细胞株SW480的杀伤活性。但ABPS在抗结直肠癌中的作用机制还不明确。[0003]因此，本领域亟需研究牛膝多糖在抗结直肠癌中的用途。发明内容

[0004]本发明的目的是提供牛膝多糖在抗结直肠癌中的应用。[0005]本发明的第一方面，提供了一种牛膝多糖的用途，用于制备细胞因子的促进剂,或用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于促进或上调细胞中的细胞因子表达，[0006]其中，所述的细胞因子选自下组：Bmp3、Csf2、Ifnb1、Il15、Il17c、Il17f、Il2、Il23a、Il5、Inhba、Adipoq、Csf3、Il10、Il24、Il6、Inha、或其组合。[0007]在另一优选例中，所述细胞因子来自哺乳动物。[0008]在另一优选例中，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物，较佳地包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物(如人)。[0009]在另一优选例中，所述促进剂包括促进所述细胞因子的表达，或提高所述细胞因子的表达量。

[0010]在另一优选例中，所述促进剂包括促进所述细胞因子的表达量提高一倍以上(与对照相比)。

[0011]在另一优选例中，所述细胞因子来自肠细胞。[0012]在另一优选例中，所述肠细胞包括：结肠细胞、直肠细胞、或其组合。[0013]在另一优选例中，所述细胞因子来自正常细胞或癌细胞，较佳地，来自正常结肠细胞、正常直肠细胞、结直肠癌细胞、或其组合。[0014]在另一优选例中，所述的细胞包括正常细胞；和/或[0015]所述细胞因子选自下组：Bmp3、Csf2、Ifnb1、Il15、Il17c、Il17f、Il2、Il23a、Il5、Inhba、或其组合。

[0016]在另一优选例中，用于制备来自正常细胞的细胞因子的促进剂，所述细胞因子选自下组：Bmp3、Il17c、Il17f、Il23a、Il5、或其组合。[0017]在另一优选例中，所述正常细胞为正常结肠细胞、正常直肠细胞、或其组合。[0018]在另一优选例中，所述细胞包括癌细胞；和/或[0019]所述细胞因子选自下组：Adipoq、Csf3、Il10、Il24、Il5、Il6、Inha、或其组合。

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在另一优选例中，用于制备来自癌细胞的细胞因子的促进剂，所述细胞因子选自

下组：Adipoq、Csf3、Il5、Il6、或其组合。[0021]在另一优选例中，所述癌细胞为结直肠癌细胞。[0022]本发明的第二方面，提供了一种牛膝多糖的用途，用于制备细胞因子的抑制剂，或用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于抑制或下调细胞中的细胞因子表达，[0023]其中，所述的细胞因子选自下组：Cd40lg、Il10、Il13、Il16、Il1b、Lta、Ltb、Tnf、Tnfsf8、Il23a、Spp1、或其组合。[0024]在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制所述细胞因子的表达，或降低所述细胞因子的表达量。

[0025]在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制所述细胞因子的表达量降低一倍以上(与对照相比)。

[0026]在另一优选例中，所述细胞因子来自哺乳动物。[0027]在另一优选例中，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物，较佳地包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物(如人)。[0028]在另一优选例中，所述细胞因子来自肠细胞。[0029]在另一优选例中，所述肠细胞包括：结肠细胞、直肠细胞、或其组合。[0030]在另一优选例中，所述细胞因子来自正常细胞或癌细胞，较佳地，来自正常结肠细胞、正常直肠细胞、结直肠癌细胞、或其组合。[0031]在另一优选例中，所述细胞包括正常细胞；和/或[0032]所述细胞因子选自下组：Cd40lg、Il10、Il13、Il16、Il1b、Lta、Ltb、Tnf、Tnfsf8、或其组合。

[0033]在另一优选例中，用于制备来自正常细胞的细胞因子的抑制剂，所述细胞因子选自下组：Cd40lg、Il16、Il1b、Ltb、Tnf、或其组合。[0034]在另一优选例中，所述正常细胞为正常结肠细胞、正常直肠细胞、或其组合。[0035]在另一优选例中，所述细胞包括癌细胞；和/或[0036]所述细胞因子选自下组：Il13、Il23a、Spp1、或其组合。[0037]在另一优选例中，所述癌细胞为结直肠癌细胞。[0038]本发明的第三方面，提供了一种牛膝多糖的用途，用于制备预防和/或治疗癌症的药物组合物或制剂。

[0039]在另一优选例中，所述癌症为结直肠癌，较佳地为炎症性结直肠癌。[0040]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0041]图1显示了ABPS对小鼠结直肠中细胞因子谱的影响。图A：将C57BL/6小鼠分成两组，每组10只。一组为实验组，按如图所示时间点进行ABPS灌胃处理，剂量为200mg/kg。另一组为对照组，按如图所示时间点进行无菌水灌胃处理。图B和图C：取小鼠结直肠，然后提取总RNA、逆转录成cDNA进行PCR Array检测84种小鼠细胞因子的表达情况，其中以对照组组

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织中细胞因子表达水平作为对照，84种细胞因子上调或下调情况热图分析(图B)以及其具体上调倍数(图C)。

[0042]图2显示了ABPS对诱发小鼠结直肠癌的预防作用及可能的作用机制。其中，图A：将C57BL/6小鼠分成两组，每组10只，并采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导小鼠炎症相关性结直肠癌模型，期间进行灌胃处理：实验组按200mg/kg牛膝多糖灌胃处理，对照组用无菌水进行灌胃处理。图B：ABPS灌胃处理组中结直肠癌成瘤数目远远少于对照组。图C和图D：使用PCR Array方法检测84种小鼠细胞因子的表达情况，84种细胞因子上调或下调情况热图分析(图C)以及其具体上调倍数(图D)。

具体实施方式

[0043]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，牛膝多糖可以用于制备选自下组细胞因子的促进剂：Bmp3、Csf2、Ifnb1、Il15、Il17c、Il17f、Il2、Il23a、Il5、Inhba、Adipoq、Csf3、Il10、Il24、Il6、Inha、或其组合。牛膝多糖还可以用于制备选自下组细胞因子的抑制剂：Cd40lg、Il10、Il13、Il16、Il1b、Lta、Ltb、Tnf、Tnfsf8、Il23a、Spp1、或其组合。本发明检测了牛膝多糖对正常小鼠结直肠中细胞因子谱的影响，接着采用小鼠炎症相关性结直肠癌模型，检测ABPS抗结直肠癌的活性及其作用机制。牛膝多糖在小鼠结直肠癌模型，能够治疗和/或预防肿瘤；牛膝多糖在正常小鼠似乎有轻度免疫刺激作用；牛膝多糖在结直肠癌模型小鼠的肿瘤预防作用可能是由通过抑制IL23和肠炎的发生。在此基础上，完成了本发明。[0044]术语

[0045]除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0046]牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharides,ABPS)是中药牛膝根中的生物活性多糖。实验和临床研究表明，它具有增强肿瘤患者对抗肿瘤治疗的耐受、调节免疫、延缓衰老、降血糖和通络活血等药理功能。ABPS成分均一，由果糖：葡萄糖(8：1)组成，其分子量为1400D，并且其化学结构已经被鉴定出来。[0047]本发明的优点主要包括：

[0048]1.本发明发现牛膝多糖能够预防和/或治疗肿瘤，并且发现牛膝多糖的肿瘤治疗预防作用可能是由通过抑制IL23和肠炎的发生。

[0049]2.本发明发现牛膝多糖对正常细胞有轻度免疫刺激作用。

[0050]3.本发明首次发现牛膝多糖可以用于制备选自下组细胞因子的促进剂：Bmp3、Csf2、Ifnb1、Il15、Il17c、Il17f、Il2、Il23a、Il5、Inhba、Adipoq、Csf3、Il10、Il24、Il6、Inha、或其组合；还可以用于制备选自下组细胞因子的抑制剂：Cd40lg、Il10、Il13、Il16、Il1b、Lta、Ltb、Tnf、Tnfsf8、Il23a、Spp1、或其组合。因此，本发明为开发牛膝多糖在抗结直肠癌中的新药物奠定了基础，十分具有使用价值。[0051]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,19)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否

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则百分比和份数是重量百分比和重量份数。[0052]实验方法：[0053]1.1 ABPS处理C57BL/6小鼠

[00]将ABPS干粉溶于无菌水配成适量浓度，然后以200mg/kg剂量进行小鼠灌胃给药，每隔一周灌胃一次，共灌胃12次，然后进行相关分析。

[0055]1.2氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导的小鼠炎症相关性结直肠癌模型构建

[0056]订购6-8周龄C57BL/6雄性小鼠每组各10只，放于SPF级动物房进行饲养至体重25g左右，然后进行动物模型诱导。首先在小鼠腹腔第一次注射致癌剂氧化偶氮甲烷(AOM)处理，一周后再第二次腹腔注射AOM处理。AOM处理一周后，小鼠饮用水换成含DSS的饮用水，持续饮用一周，然后换成正常饮用水持续2周，接着以此交替再DSS处理三次，即可得小鼠炎症性结直肠癌模型。[0057]1.3 PCR Array分析84个细胞因子的表达

[0058]取适量小鼠正常结直肠组织或小鼠炎症相关性结直肠癌肿瘤组织，利用Trizol法提取总RNA，然后利用逆转录试剂盒(Takara，日本)合成第一链cDNA，用于下面PCR Array检测。使用凯杰的RT2ProfilerTMPCR Array Mouse Common Cytokines来分析相关84个基因的表达，使用ABI ViiA7标准PCR系统进行PCR分析。[0059]实施例1 ABPS对小鼠结直肠中细胞因子谱的影响

[0060]为了系统性分析ABPS对结直肠中细胞因子表达的影响，本实验选用C57BL/6小鼠进行连续3个月灌胃ABPS处理。将C57BL/6小鼠分成两组，每组10只。一组为实验组，按如图1A所示时间点进行ABPS灌胃处理，剂量为200mg/kg。另一组为对照组，按如图1A所示时间点进行无菌水灌胃处理。然后剥离结直肠，提取总RNA并逆转录成cDNA进行PCR Array分析(见实验方法)。检测84种小鼠细胞因子的表达情况，其中以对照组组织中细胞因子表达水平作为对照。

[0061]84种细胞因子上调或下调情况热图分析如图1B所示，其具体上调倍数如图1C所示。结果表明，ABPS处理组与对照组相比，上调基因(Fold>2)共有10个，包括：Bmp3、Csf2、Ifnb1、Il15、Il17c、Il17f、Il2、Il23a、Il5和Inhba；下调基因(Fold<-2)共9个，包括：Cd40lg、Il10、Il13、Il16、Il1b、Lta、Ltb、Tnf和Tnfsf8。结果表明，牛膝多糖在正常小鼠似乎有轻度免疫刺激作用。[0062]实施例2 ABPS对诱发小鼠结直肠癌的预防作用[0063]已有文献报道，ABPS刺激DC能协同CIK提高对人结直肠癌细胞株SW480的杀伤活性，但ABPS在体内对结直肠癌的抑制作用还未报道。本实施例首先采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)法构建炎症相关性结直肠癌模型，为了进一步考察ABPS对诱发小鼠结直肠癌的预防作用，在建模期间对小鼠进行ABPS灌胃处理，按如图2A所示时间点每周灌胃一次，与图1保持同步。具体地，将C57BL/6小鼠分成两组，每组10只，并采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导小鼠炎症相关性结直肠癌模型，期间进行灌胃处理：实验组按200mg/kg牛膝多糖灌胃处理，对照组用无菌水进行灌胃处理。实验结束后对小鼠进行剥离结直肠处理，并对各组小鼠结直肠中成瘤数目进行统计。为进一步分析ABPS的抗结直肠癌作用是否与影响细胞因子的表达相关，研究牛膝多糖对诱发小鼠结肠癌的化学预防作用,

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并探讨其可能的作用机制。本实施例对癌组织进行PCR Array分析，使用PCR Array方法检测84种小鼠细胞因子的表达情况。

[00]结果发现ABPS灌胃处理组中结直肠癌成瘤数目远远少于对照组(如图2B所示)。84种细胞因子上调或下调情况热图分析如图2C所示，以及其具体上调倍数如图2D所示。ABPS处理组与对照组相比，上调基因(Fold>2)共有7个，包括：Adipoq、Csf3、Il10、Il24、Il5、Il6和Inha；下调基因(Fold<-2)共3个，包括：Il13、Il23a和Spp1。[0065]结果表明，ABPS对结直肠癌具有显著的预防作用，能够预防肿瘤发生。牛膝多糖在结直肠癌模型小鼠的肿瘤预防作用可能是由通过抑制IL23和肠炎的发生。[0066]讨论

[0067]ABPS对炎症性诱导结直肠癌具有良好的预防作用，同时其作用机制很可能与细胞因子的表达相关。目前本发明发现了一些可能的相关细胞因子，接下来将通过qPCR验证这些差异基因的真实性，并进一步通过细胞株水平来阐明ABPS的具体作用机制。[0068]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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图2

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