黄花倒水莲多糖的纯化、表征与体外抗氧化活性研究

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2019.14.009

云oodResearchAndDevelopment食品研究与开发圆园19年7月

第40卷第14期

51

表征与黄花倒水莲多糖的纯化、

体外抗氧化活性研究

张小梅，刘素莲，张锐锐，林冰梅，王晶晶，林家逊*，许有瑞*

（桂林医学院药学院，广西桂林1004）

（polysaccharideofPolygalafallaxHemsl.，摘要：提取纯化黄花倒水莲多糖PFP），对其结构进行表征，并测定其体外抗氧化活性。采用水提醇沉法提取PFP，运用Sevag法除蛋白、活性炭脱色以及G-75葡聚糖凝胶柱层析对其进行纯化分离获得不同的多糖组分。分别用红外光谱（infraredspectrum，IR）、凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography，（highGPC）与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP）柱前衍生高效液相色谱最后测定PFP组分对DPPH自由基、performanceliquidchromatography，HPLC）法对PFP组分进行表征分析。羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS垣自由基的清除率来评价其体外抗氧化活性。经分离纯化得到两种PFP组分（PFP1与PFP2）。其中PFP1的分子量为20794Da，多分散指数为1.32，红外光谱中呈现多糖的典型特征吸收峰，PFP1是由甘露且摩尔比为0.09颐1颐0.48颐糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖与一种未知单糖组成的一种杂多糖，性，为今后进行更深入的研究与开发利用提供依据。

0.颐0.71颐0.35。PFP1对4种自由基均有清除能力，且在一定浓度范围内呈正相关。因此PFP在体外具有抗氧化活

关键词：黄花倒水莲；多糖；抗氧化活性；自由基；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色谱

Purification，CharacterizationandinvitroAntioxidantActivityofPolysaccharidesfrom

ZHANGXiao-mei，LIUSu-lian，ZHANGRui-rui，LINBing-mei，

（SchoolofPharmacy，GuilinMedicalUniversity，Guilin1004，Guangxi，China）

粤遭泽贼则葬糟贼：ThepolysaccharideofPolygalafallaxHemsl.（PFP）wasextractedusingthemethodofwaterextractionandalcoholprecipitation.AfterdeproteinizationbySevagmethodanddecolorationbyactivecarbon，pre-columnderivatizationhighperformanceliquidchromatography（HPLC）method.Theresultsshowthatheteropolysaccharideandcomposedofmannose，glucuronicacid，rhamnose，glucose，galactose，arabinoseandwithamolarratioof0.09颐1颐0.48颐0.颐0.71颐0.35.Additionally，invitroantioxidantactivityassaysresearchofPFP.

radicalandABTS垣radicalinadose-dependentmanner，whichcontributestoanintensivedevelopmentandpyrazalonehighperformanceliquidchromatography（PMP-HPLC）

运藻赠憎燥则凿泽：PolygalafallaxHemsl.；polysaccharides；antioxidantactivity；radical；1-phenyl-3-methyl-5-weight-averageMwofPFP1was20794Dawithapolydispersityindexof1.32，anditwasainfraredspectrum（IR），gelpermeationchromatography（GPC）and1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone（PMP）PFP1andPFP2wereobtainedbySephadex-G75columnchromatographygel，andthePFP1wascharacterizedby

WANGJing-jing，LINJia-xun*，XUYou-rui*

PolygalafallaxHemsl.

suggestedthatPFP1presentsscavengingactivitytowardDPPHradical，hydroxylradical，superoxideanion

作者简介：张小梅（1998—），女（汉），本科生，研究方向：中药活性成分的研究与开发。

林家逊（19—）天然产物化学；许有瑞（1980—）*通信作者：，男，高级实验师，研究方向：，男，讲师，博士，研究方向：中药活性成分的研究与开发。

52

引文格式：51-56

张小梅，等：黄花倒水莲多糖的纯化、表征与体外抗氧化活性研究

基础研究

张小梅，刘素莲，张锐锐，等.黄花倒水莲多糖的纯化、表征与体外抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2019，40（14）：ZHANGXiaomei，LIUSulian，ZHANGRuirui，etal.Purification，CharacterizationandinvitroAntioxidantActivityofPolysaccharidesfromPolygalafallaxHemsl.[J].FoodResearchandDevelopment，2019，40（14）：51-56

黄花倒水莲（PolygalafallaxHemsl.）为远志科远志属灌木或小乔木，又名假黄花远志、黄花参、倒吊黄、吊吊黄、念健、一身保暖、鸭仔兜等，生于山谷林下水旁荫湿处，分布于江西、福建、湖南、广东、广西和云南[1]。其根入药，性平，味甘、微苦，具有补气血、健脾利湿、活血调经之功效[2]，可用于治疗病后体虚、腰膝酸痛、跌打损伤、急慢性肝炎，抗衰老等，为瑶、苗、壮等少数民族的常用药物[3-4]，也被作为草药中的“党参”、“黄芪”来使用[5]。现代研究表明黄花倒水莲含有多种化学成分，如皂苷、多糖、酚类、酮类、寡糖酯、有机酸等[6]。其中，多糖作为黄花倒水莲的活性成分之一能够提高机体的抗应激能力[5]，也能提高正常小鼠的非特异性免疫和特异性免疫[7]，此外黄花倒水莲多糖

（polysaccharideof损Polygala伤的小鼠fallax有保Hemsl.护作用，[8]PFP。

）还对四氯化碳致急性肝

基于此，本研究参照前期优选的提取工艺，对PF原活性Ps进行，以期提取为、分今离后对、纯化与PFPs表进行征，更并深评价入的研究与其体外抗氧开发化

利用提供理论依据。1材料与方法

1.1黄材料花倒与仪水器

莲根：桂林市六合路中药材市场；无水

乙醇、95%乙醇、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、浓硫酸、维生素C（VC）：西陇化工股份有限公司；三氟乙酸（triflu原oroaceticphenyl-3-acid2-三硝基methyl-5-pyrazalone，TFA）、1-苯基-3-甲苯肼（2，2-diphenyl，PMP基-5--1）-picrylhydrazyl、吡1，唑啉1-二酮苯（基1--DPPH盐[2），2、’2-azino-bis，2-联氮-2（（3-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic

乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵

，

acid甘露），糖（ABTS]Man）：、Sigma阿拉伯公司糖（；Ara葡萄）、糖半（Glc乳糖）（、鼠Gal李糖）：（中国食Rha）、品药品检定研究院；葡聚糖凝胶G-75：上海蓝季科技发展有限公司。以上试剂均为国产分析统有限公司；CTFD-12S冷冻干燥机：纯。

BT224S精密分析电子天平北京：赛青多利岛永斯合仪创器系

信电

子科技有限公司；80-2B低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；HC-3618R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；N-1100旋转蒸发仪：上海爱朗仪20器有低温冷限公司却；SHB-循环泵芋：郑循环水州式长多用城科真工空贸泵有、DLSB-10/

BV1005-E漩涡混合限公司；A210049傅立叶变换红器外：线上光海谱柯淮仪：岛津仪器企有业限公司管理（中；国）有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津仪器公司1.2。1.2.1试验称取黄花方一倒法

定水量低温莲多糖干燥的提的取

黄花倒水莲粉末（14目），

无水乙醇回流脱脂3次（2h/次），过滤，药渣挥去乙醇。3以次30），过倍滤量蒸，合馏并水滤，液82并益减水压浴浓缩提，取在2.4浓缩h（重液中复加提入无取

水乙醇至醇浓度为90%，于4益的冰箱内静置过夜。取沉淀，经Sevag法除蛋白，活性炭脱色，冷冻干燥后1.2.2得到黄黄花花倒倒水水莲莲多多糖糖。

称取10g葡聚糖凝的胶纯化G-75于蒸馏水中加热溶

胀，装柱（直径2cm），用蒸馏水平衡后，称取黄花倒水莲多糖0.05g，溶于1mL蒸馏水中，上样，经蒸馏水洗脱（0.3mL/min），用具塞试管收集洗脱液（2mL/管），取其中0.2mL用苯酚-浓硫酸法检测多糖，绘制黄花倒水莲多糖的洗脱曲线。依照洗脱曲线合并洗脱液，冷1.2.3冻干燥分后子得量到测定

不同分子量的多糖组分。

多糖组分的分子量及其分布由凝胶渗透色谱法

测定（gelpermeationchromatography，GPC）。GPC色谱条件PWXL：LC20色谱泵柱，（RID-207.8mm示伊300差折mm光，检13测滋器m），，TSKgel流动相GM为

原0.06窄分布%的NaN葡3水溶液，流速为0.6mL/min，柱温为35益，1.2.4红外光聚谱糖（作infrared为标准spectrum物。

取黄花倒水莲多糖组分适量，，同IR）KBr测定混合研磨均

4匀000，压cm片后进行红外光谱分析，扫描范围为400cm-1-1。

~

基础研究

张小梅，等：黄花倒水莲多糖的纯化、表征与体外抗氧化活性研究

1.2.51.2.5.1PFP分别称取单1糖的标准单糖甘露溶液组成分糖、葡萄的配析

糖制

醛酸、

鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖标准品10mg，配制成浓度为1.0mg/mL1.2.5.2的标准溶液PFP。

1的水解水3mol/L称取解4h的10。反应TFAmg结1PFP束mL后加，1密置入封于具氢，摇塞氧匀试化后管钠溶液置中，于调节105加入浓益pH油值浴度为中

为

中1.2.5.3性，1000分别移取单糖r/min标准离各单品心糖及10标准PFPmin，取上清液待用。溶液1水解产物的PMP衍生化

和PFP置1水解产物0.5mL，

0.5于具水浴mol/L塞试管中，依次加入0.3mol/L氢氧化钠0.5mL，加热的反应PMP1.5甲醇溶液h。反应结0.5束mL后，取涡出旋试混管匀冷后至于2570益益，

加入0.3mol/mL盐酸溶液0.5mL中和，涡旋混匀后，加入氯仿萃取，涡旋振荡2min，4500r/min离心10min，取上清液重复用氯仿萃取2次[9]。将萃取完的上清液liquid过0.45滋m滤膜，待高效液相色谱（highperformance1.2.5.4chromatography色谱色柱谱条件

，HPLC）进样测定。：AgilentTC-C流动相为0.05mol/mL磷酸盐缓18（4.6mm伊250mm，5滋m），

冲液（pH=6.8）-乙腈78颐22，体积比），流速为1.0mL/min，柱温35益，检测波1.2.6长21.2.6.1PFPnm，进样体积20滋L。参照文DPPH1体外抗氧献[10]自由，在基化试清除活性管中率依次的测定

加入3mL不同浓度

的DPPH黄花倒水莲多糖溶液与新鲜配制的1mL0.1后，于无517水nm乙醇溶液处测定其，摇吸匀光度，在。25以益V暗C作处为放置mmol/L阳性30对min照，

按下式计算DPPH自由基清除率：

清除率/%=[1原（A式中：Aii为加入多糖溶液原A或j）/AVoC时]伊的100

吸收值；A只加样品时的背景吸收值；Aj为

时的吸收值。

o为蒸馏水代替样品溶液

1.2.6.2参照文羟基自献[11]由，基在清除试管率中的依次测定

FeSO加入2mL1.8mmol/L

不同浓4溶液，1.5mL1.8mmol/L水杨酸乙醇溶液，1mL度黄花倒水莲多糖溶液，1mL0.3%H摇匀，在25益放置30min后于520nm处测定2O其2溶液，

吸光度。以抗坏血酸作为阳性对照，按下式计算羟基自由基清除率：

清除率/%=[1原（A式中：Aii为加入多糖溶液原A或j）/AVoC时]伊的100

吸收值；Aj为

53

只加样品时的背景吸收值；A馏水代替样品溶液

1.2.6.3时的吸收参考超值文氧。

o为蒸献阴[12]离子，在清除试管率中的依次测定

加入0.5mL不同浓

度的黄花倒水莲多糖溶液，5mL0.05mol/LTris-HCl缓冲液，在25益放置10min后加入0.2mL6mmol/L邻苯三酚，迅速摇匀，立即在315nm处每30s测定1次吸光度，共测4min。计算样品吸光度值随时间的变化率，以抗坏血酸作为阳性对照，按下式计算超氧阴离子自由基清除率：

清除率/%=[1原（A式中：Ai原Aj）/Ao]伊的100

吸收值；A只加样品时的i为加入多糖溶液或V背景吸收值；AC时j为

o为蒸馏水代替样品溶液

1.2.6.4时的吸收参考ABTS值。

垣自由基清除率的测定

2.45mmol/L文献K[13]，分别配制7mmol/LABTS溶液与

mL，25益2S避2O8溶液，然后按1颐1体积比混合定容至25光反应15h，加蒸馏水稀释.7倍至其在734nm处吸光度为0.70依0.02后，30益保温备用。移取该溶液0.2mL至试管中，再加入5mL不同浓度黄花倒水莲多糖溶液，充分混合，避光25益反应6min后，于734nm处测量吸光度，以抗坏血酸作为阳性对照，按下式计算ABTS+自由基清除率：

清除率/%=[1原（A式中：Ai原Aj）/Ao]伊100

只加样品时的i为加入多糖溶液或V背景吸收值；AC时的吸收值；A水代替样品溶液

j为

时的吸收值。o为蒸馏2

2.1结果与分析

黄黄花花倒倒水水莲莲多多糖糖经的分G-75离纯葡化聚糖凝胶柱洗脱分离

后的曲线如图1。

1.51.00.50.0

01020

管数

304050

图1黄花倒水莲多糖的洗脱曲线

Fig.1ElutioncurveofrefinedPFPonSephadexG-75

chromatographycolumn

（

张小梅，等：黄花倒水莲多糖的纯化、表征与体外抗氧化活性研究

201510500

5

10

15

20

25

基础研究

PFP1来说，PFP2的质量极少，因此本研究只对PFP1进2.2分子量及其分布的测定

GPC分析结果见图2。行了表征和体外抗氧化活性测定。

然而，如图1，得到PFP1和PFP2两个组分。相对于

分散指数为1.32，表明经葡聚糖G-75凝胶柱层析后分离得到的PFP1具有很高的纯度。2.3IR分析

PFP1的IR见图3，其中具有典型的多糖吸收特

可知PFP1的分子量为20794Da，由图2可知，多

保留时间/min

30

征峰，包括3369cm-1处强而宽的O-H伸缩振动峰，1635cm-1处较强的C-O伸缩振动峰和1413cm-1C-H

150

图2PFP1的GPC色谱图

变角振动峰。

Fig.2GPCchromatogramofPFP1

100

50

0

37503000

波数/cm

2250

-1

1500750

图3PFP1的IR图Fig.3IRspectrumofPFP1

分离

2.4.1混合标准单糖和PFP1水解产物PMP衍生物的

混合标准单糖和PFP1水解产物PMP衍生物的

2.4PFP1的单糖组成分析

葡萄糖醛酸、鼠李留时间得出PFP1主要是由甘露糖、

标准单糖数量有限，仍有一种单糖种类未被确认。

糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。但是由于选取的2.4.2PFP1的单糖组成

HPLC色谱图见图4。

将标准单糖溶液制成一系列不同浓度的对照品

PMP衍生化后的产物有着很好的分离效果。经比较保

60050040030020010000

5

10

A

由图4可知，6种标准单糖以及PFP1水解后经

溶液，按1.2.5的步骤进行单糖衍生及色谱分析。以对照品溶液的浓度作为Y，相应的峰面积作为X进行拟

1

2

3

45

6

保留时间/min

15202530

基础研究

6005004003002001000

张小梅，等：黄花倒水莲多糖的纯化、表征与体外抗氧化活性研究

2

431

0

5

10

615

20

25

30

5

55

B

7

保留时间/min

A.混合标准单糖；B.PFP1水解产物；1.甘露糖；2.葡萄糖醛酸；3.鼠李糖；4.葡萄糖；5.半乳糖；6.阿拉伯糖；7.未知。

图4PMP衍生物的HPLC色谱图

Fig.4HPLCchromatogramsofderivativesofPMP

相关系数及线性范围，合，得到各单糖的回归方程、见表1。由PFP1中各单糖的峰面积，计算得PFP1的单糖组成摩尔比为：0.09颐1颐0.48颐0.颐0.71颐0.35。

表1各单糖的标准曲线

Table1Monosaccharidestandardcurve

单糖甘露糖葡萄糖醛酸鼠李糖葡萄糖半乳糖阿拉伯糖

回归方程Y=34862X垣1340Y=347X垣47323Y=33879X原499Y=37959X原35146Y=37779X原33304Y=52972X垣296

线性范围（/滋g/mL）相关系数

10~50010~50010~50010~50010~50010~500

0.99941.00001.00000.99981.00001.0000

1008060402000

2

4

6

8PFP

VC

B

浓度（/mg/L）

10C

1008060402000

2

4

6

8

10

12

2.5PFP1体外抗氧化活性

离子自由基和ABTS垣自由基的清除率结果见图5。

+

PFP1分别对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴由图5可知，PFP1对DPPH自由基、羟基自由基、

PFP

VC

超氧阴离子自由基和ABTS自由基均具有一定的清除能力，且呈现浓度依赖性关系，但其清除能力与阳性DPPH自由基的清除率达到最大值81%，而VC在浓度

1008060402000

2

4

6

8

10

PFP

VC

A

浓度（/mg/L）

14D

16

对照VC相比则较弱。当浓度为5mg/L时，PFP1对

1008060402000.0

0.5

1.0

1.5

2.0PFP

VC

为1mg/L时就达到最大清除率92%。对于羟基自由

浓度（/mg/L）

2.5

A.DPPH自由基；B.羟基自由基；C.超氧阴离子自由基；

D.ABTS垣自由基。

（n=3）图5PFP1对各自由基的清除率Fig.5ClearanceoffreeradicalsbyPFP1

浓度（/mg/L）

56

张小梅，等：黄花倒水莲多糖的纯化、表征与体外抗氧化活性研究

[3]

基础研究

率98.5%。对于超氧阴离子自由基，PFP1在浓度为15mg/L时，清除率达到最大值100.3%，而VC在浓度为5mg/L时达到最大清除率98.2%。对于ABTS垣自由基，PFP1的清除率达到最大值99.6%时的浓度为2.5mg/L，而VC达到最大清除率99.8%时的浓度则为0.25mg/L。3结论

本研究通过水提醇沉法获得PFP，经Sevag法脱蛋白、活性炭脱色以及葡聚糖凝胶-G75柱分离纯化获HPLC法对量大的PFP1组分进行表征分析。结果显示得2种PFP组分，分别用IR、GPC与柱前衍生PMP-其IR光谱中呈现多糖的典型特征吸收峰，分子量为

94.3%，而VC在浓度为0.5mg/L时就达到最大清除

基，PFP1在浓度为7.5mg/L时，清除率达到最大值

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20794Da，多分散指数为1.32。而且PFP1是由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖与一种半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、0.颐0.71颐0.35。此外PFP1对4种自由基均有清除能力，且在一定范围内呈正相关。本研究为PFP进行更未知单糖组成的一种杂多糖，摩尔比为0.09颐1颐0.48颐

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收稿日期：2018-10-09