实验8 植物组织中可溶性卵白质含量的测定之答禄夫天创作
创作时间：二零二一年六月三十日 Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原 理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与卵白质的反应,
其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下, 与铜试剂作用生成卵白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原, 生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物, 颜色深浅与卵白含量成正相关.在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍.由于肤键显色效果增强, 从而减少了因卵白质种类引起的偏差.该法适于微量卵白的测定(范围为5～l00μg卵白质). [资料、仪器设备及试剂] (一)资料 各种植物资料.
(二)仪器设备 722分光光度计, 离心机, 恒温水浴, 定量加样器, 冷凝回流装置一套, 研钵, 离心管, 刻度移液管, 微量滴定管, 试管等.
(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H. (2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：
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A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合.
B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合.
使用前将A与B按50:1的比例混合即成, 此试剂只能在使用当天配制.
(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04.H20)100g, 钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g, 加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中.之后加入85％的H3PO450mL, 浓Hcl 100 mL, 安上回流装置(使用磨口接头, 若用软木塞或橡皮塞时, 就必需用锡铂纸包起来), 使其慢慢沸腾10h.冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml, 溴水2-3滴, 翻开瓶口煮沸15min, 以逐出过量的溴, 冷却后溶液呈黄色（若仍绿色, 须再滴加几滴溴水, 继续煮沸15min）.待冷却后稀释至1000ml, 过滤入棕色瓶中保管.使用时年夜约加水1倍, 使最终浓度相当于1mol/L酸度.
因此在使用前应进行标定.标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内, 用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定, 酚酞作指示剂, 当溶液突然转红再转灰绿时, 即为滴定终点.计算其相当的酸度, 用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1mol/L的酸度. 在测按时要注意, 因为酚试剂仅在酸性稳定, 但此实验的瓜只在pH≠10的情况
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下发生, 所以当加酚试剂时, 必需立即混匀, 以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应, 否则会使显色水平减弱. ⑷标准卵白质溶液：称取25mg牛血清卵白, 溶于100ml蒸馏水中, 使终浓度为250μg/ml. [实验步伐]
（一）标准曲线的绘制
（1） 取18mm×200mm试管7支, 1-7编号, 分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准卵白质溶液, 用蒸馏水补足1mL, 使每管含卵白量分别为0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L.
（2） 用定量加样器给每支试管中加入5mL甲液, 混匀, 于30℃下放置10min.
（3） 再向试管中喷射加入0.5mL乙液, 立即振荡混匀, 在30℃下准确保温30min
（4） 以不加标准卵白的1号管为空白, 在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度.以标准卵白浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标, 绘制标准曲线.
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(二)样品的测定 样品的提取：称取鲜样0．5g, 用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后, 10000 r／min离心10min, 取上清液1．0mL（视卵白质含量适当稀释)于试管中, 然后重复标准曲线绘制中的2～4步伐, 以空白管调零, 测定吸光度.根据吸光度查标准曲线, 求出样品中的卵白质含量.
[结果计算] 样品中卵白的含量＝ (mg／g) 式中：C为查标准曲线值, μg；VT为提取液总体积, mL；WF为样品鲜重, g；Vs为测按时加样量, mL. '
注意事项 还原物质, 其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰. Ⅱ．考马斯亮蓝G-250染色法
[原 理] 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定卵白质含量属于染料结合法的一种.
该染料在游离状态下呈红色, 在稀酸溶液中当它与卵白质的疏水区结合后酿成青色, 前者最年夜光吸收在465nm, 后者在59511nm.在一定卵白质浓度范围内(1～1000μg), 卵白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与卵白质含量成正比, 故可用于卵白质的定量测定.
考马斯亮蓝G-250与卵白质结合反应十分迅速, 2min左右即到达平衡.其结合物在室温下1h内坚持稳定.此法灵敏度高(比斐林-酚
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法还高4倍), 易于把持, 干扰物质少, 是一种比力好的定量法.其缺点是在卵白质含量很高时线性偏低, 且分歧来源卵白质与色素结合状况有一定不同. [资料、仪器设备及试剂]
(一)资料 小麦叶片及其他植物资料.
(二)仪器设备 722分光光度计, 研钵, 烧杯, 量瓶, 移液管, 具塞刻度试管等. (三)试剂
(1)标准卵白质溶液：100μg／mL牛血清白卵白：称取牛血清卵白25μg, 加水溶解并定容至100mL, 吸取上述溶液40mL, 用蒸馏水稀释至100mL即可.
(2)考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250, 溶于50mL 90％乙醇中, 加入100mL 85％(W／V)的磷酸, 再用蒸馏水定容到1L, 贮于棕色瓶中.常温下可保管一个月. [实验步伐]
(一)标准曲线的绘制 取6文具塞试管, 按表2-29-1加入试剂(0～100μg／mL的标准卵白).混合均匀后, 向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液, 摇匀, 并放置5min左右, 用1cm光径比色
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皿在595nm下比色测定吸光度.以卵白质浓度为横坐标, 以吸光度为纵坐标绘制标准曲线. (二)样品测定
(1)样品提取.方法与斐林-酚试剂法相同.
(2)吸取样品提取液1．0mI, 放人具塞试管中(每个样品重复2次), 加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液, 充沛混合, 放置2min后在595nm下比色, 测定吸光度, 并通过标准曲线查得卵白质含量. [结果计算] 样品中卵白质的含量＝ (mg／g) 式中：C、VT、WF、Vs的暗示意义与斐林-酚法相同. Ⅲ．紫外吸收法
[原 理] 卵白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最年夜光吸收.由于各种卵白质中都含有酪氨酸, 因此280nm的光吸收度是卵白质的一种普遍性质.在一定水平下, 卵白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比, 故可作定量测定.核酸在紫外区(260nm)也有吸收, 可通过校正加以消除. [资料、仪器设备及试剂]
(一)资料 ． 小麦叶片及其他植物资料.
(二)仪器设备 紫外分光光度计, 离心机, 刻度移液管.
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(三)试剂 0． 1mol/L PH 7．0磷酸缓冲液. [实验步伐]
（一）样品提取 与菲林-酚法相同.
（二）测定 取适量的样品提取液, 根据卵白质浓度, 用0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲液适当稀释后, 用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度, 以pH7.0磷酸缓冲液为空白调零.
[结果计算] 卵白质浓度=1.45A280-0.744A260（mg/mL） 卵白质含量= 式中：1.45和0.74为校正值：A280为卵白质溶液在280nm处的吸光度；A260为卵白质溶液在260nm处的吸光度；n为稀释倍数.
思考题 1．测定植物体内可溶性卵白质含量有什么意义和用途?试举二例说明.
2．三种测定方法各有何优缺点?在实验中如何选择合适的方法并克服其缺点?
3．福林-酚试剂法测定卵白质含量的原理是什么?测定中应注意什么问题?
创作时间：二零二一年六月三十日
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