丙肝病毒核酸扩增荧光检测

1． 目的：保证HCV DNA检测结果准确、可靠。

2． 适用范围：HCV DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。

3． 负责人：操作人：原理：本试剂盒用一对丙型肝炎病毒特异引物和一条丙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以逆转录液，逆转录酶，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，先将RNA逆转录成cDNA，再用PCR体外扩增法检测丙型肝炎病毒cDNA。 4． 性能参数：检出低值＜1×103基因拷贝/ml。 5． 标本要求：

（1）标本类型：血清。

（2）标本采集：见标本采集手册。

（3）标本储存和运输：室温放置不超过2小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融，室温运输。

（4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。 6． 容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管。

7． 所需设备：SLAN-96P、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯。

8． 试剂：核糖核酸抽提试剂（亲和柱，结合缓冲液，洗涤液A，洗涤液W，洗脱液，磁珠，RNA助沉剂）；HCV-PCR反应液（513μl/管）1管；临界阳性定量质控标准品（5×103～5×107基因拷贝/ml）（150μl/管）1管；阴性质控品（150μl/管）1管；HCV内标（30μl/管）；HCV标准品Ⅰ～Ⅳ（20μl/管） 9． 校准程序（计量学溯源性）： 10．

程序步骤:：

11.1标本采集和运送

用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml，注入无菌1.5ml离心管,于室温静置2小时,转至4℃静置1小时。8000rpm离心5分钟，吸取200ul血清(注意勿带入红细胞)转入另一无菌1.5ml离心管，即为血清标本。标本可立即用于测试（48小时以内），也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送应采用0℃冰壶。 11.2标本及对照标准品的处理

加140μl标本、对照品分别至527μl结合液。分裂磁珠：吸取以上混匀静止体系667μl于亲和柱中，13000rpm离心40sec；弃去收集管废液；再重复一次。500μl洗涤液A洗涤2次：加入500μl洗涤液A，13000rpm离心40sec；再重复一次。500μl洗涤液W洗涤2次：加入500μl洗涤液W，13000rpm离心15sec；再重复一次。充分干燥：亲和柱放入离心机中13000rpm离心2min。50ul洗脱液洗脱RNA。

11.4PCR扩增仪器荧光检测操作

取单管单人份PCR反应管若干管，直接加入处理后样品（或阴阳性质控标准品）2ul，6000rpm离心数秒。将各后应管放入PCR仪器的孔反应槽内，在电脑上按对应顺序设置阴阳性质控标准品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团类和循环条件：

SLAN-96P的循环条件：45℃ 10分钟，95℃ 15分钟预变性，然后按95℃ 15秒 60℃60秒，做50个循环。单点荧光检测在60℃。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。 11.5结果分析条件的设定

SLAN-96P的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使阴性质控品Ct值为30,临界阳性质控标准品Ct值为22~24, 强阳性质控标准品Ct值为18~20,最后记录仪器自动分析计算出的Ct值. 12. 质量控制程序：

13. 干扰（如乳糜血、溶血、胆红素血）和交叉反应：乳糜血、溶血、胆红素血基本不影响本实验的测定。

14. 生物参考区间：正常人样本为阴性或0基因拷贝/ml。

15. 患者检验结果的可报告区间：Ct值<40，实验样本的HCV DNA含量（基因拷贝数/ml）=M；Ct值=40，样品 HCV 16. 警告/危急值（当适用时）：

17. 实验室解释：为丙型肝炎感染的辅助诊断以及治疗提供分子生物学上的参考依据。

18. 其它：《丙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒说明书》见试剂盒

RNA含量<1 ×103基因拷贝/ml。