第４２卷第３期 ２０１７年３月 韩ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＵＩＺＨＯＵ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩ禹 ＶＥＲＳＩＴＹ 文 贵Ｊ，ｉ１医科大学学报 Ｖｏ１．４２ ＮＯ．３ ２０１７．３ 飞峰 ２ ， ２ 李 改良６－ＯＨＤＡ注射法建立早期帕金森病大鼠模型 ；Ｉ： 成 朋 ２ ，魏 操 ，杨 梅 ，周 波 ，张春林。，焦 玲４，官志忠 ， ， ５５０００４；２．贵州医科大学地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室，贵州贵阳 ５５０００４；４．贵州医科大学附院神经内科，贵州贵阳５５０００４；５．贵州医科大学 （１．贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州贵阳５５０００４；３．贵州医科大学生物教研室，贵州贵阳病理学教研室，贵州贵阳５５０００４） ［摘 要］目的：改良６．羟基多巴胺（６－ＯＨＤＡ）立体定位注射法建立早期帕金森病（ＰＤ）大鼠模型。方法：４０ 只雄性ｓＤ大鼠随机分为ｃｏｎｔｒｏｌ组１０只，ｍｏｄｅｌ组３０只；于手术前３０ ｍｉｎ，腹腔注射地昔帕明（２５ ｍｓ／ｋｇ）及帕吉 林（５ ｍｓ／ｋｇ），ｃｏｎｔｒｏｌ组采用立体定位右侧纹状体注射生理盐水，ｍｏｄｅｌ组注射６－ＯＨＤＡ；术后第３、４周采用圆筒 测试及旋转测试测定大鼠的左前肢使用率和旋转速度，免疫组化方法检测黑质内酪氨酸羟化酶（ＴＨ）阳性神经 元数量。结果：圆筒测试显示ｍａｄｅｌ组大鼠左前肢使用率低于ｃｏｎｔｒｏｌ组（Ｐ＜０．Ｏ１），旋转测试显示ｍｏｄｅｌ组平均 向左侧旋转速度（３．４８圈／ｍｉｎ），明显快于对照组（Ｐ《０．０１），ＰＤ模型成功率为８９：６６％；免疫组化显示，ｍｏｄｅｌ 组右侧中脑黑质致密部（ＳＮｃ）部位ＴＨ阳性神经元数目较ｃｏｎｔｒｏｌ组右侧减少（４４．８１±２．８９）％，差异有统计学 意义（Ｐ＜０．０１），符合临床早期ＰＤ诊断标准。结论：改良的６－ＯＨＤＡ注射法建立早期ＰＤ大鼠模型简单易行，成 功率高。 ［关键词］６．羟基多巴胺；帕金森病；大鼠；多巴胺神经元；酪氨酸羟化酶 ［中图分类号］Ｒ７４１．０２ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００－２７０７（２０１７）０３－０２５８－０５ ＤＯＩ：１０．１９３６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１０００－２７０７．２０１７．０３．００３ Ｔｈｅ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ０ｆ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｓｔａｇｅ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ６－ＯＨＤＡ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ＨＡＮ Ｆｅｉ ，ＬＩ Ｃｈｅｎｇｐｅｎｇ ，ＷＥＩ Ｃａｏ ，Ｙａｎｇ Ｍｅｉ ，ＺＨＯＵ Ｂｏ ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕｎｌｉｎ ， ＪＩＡＯ Ｌｉｎｇ４．ＧＵＡＮ Ｚｈｉｚｈｏｎｇ ’，ＹＵ Ｗｅｎｆｅｎｇ （ ．Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｅｙ ＫａｂＬｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＥｎｄｅｍｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｆＥｔｏｈｅｎｉｃ Ｍｉｎｏｒｉｔｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００４， Ｇｕｉｚｏｕ，Ｃｈｉｈｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｆＢｉｏｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；４．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｆＮｅｏｕｒｏｌｏｇｙ ｏｆ＝Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；５．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｆ ｏＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ）ｗｉｔｈ ｉｍ— ｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ６一ＯＨＤＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｏｒｔｙ ｍａｌｅ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉ－ ｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ Ｃ，１０ ｒａｔｓ）ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ ＰＤ，３０ ｒａｔｓ）．Ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ（２５ ｍｇ／ｋｇ）ａｎｄ ｐａｒｇｙｌｉｎｅ（５ ｍｇ／ｋｇ）ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ ３０ ｍｉｎｕｔｅｓ ｂｅｆｏｒｅ ｓｕｒｇｅｒｙ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｎｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）ｏｒ ６一ＯＨＤＡ（ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ）ｉｎ ｓｔｒｉａｔｕｍ．Ｃｙｌｉｎｄｅｒ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ３ ａｎｄ ４ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｉｍｍｕ－ ［基金项目］国家自然科学基金（８１３６０１９９）；教育部科学技术研究项目（２１３０３２Ａ）；贵州省国际科技合作计划项目［批准号：黔科合外Ｇ字（２０１３）７０２６号］； 贵州省创新计划项目［黔教合协同创新中心（２０１４）０６］；贵州省教育厅项目（２０１５年贵州省普通高等学校地方病和少数民族疾病防控创新团队）；贵州省科技 计划课题任务书［黔科合重大专项字（２０１４）６００８］ 一通信作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｎｆｅｎｇｙｕ２０１３＠１３６．ｃｏｒｎ 网络出版时间：２０１７—３—１８网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５２．１１６４．Ｒ．２０１７０３１８．２３２０．０１９．ｈｔｍｌ ２５８ ３期 韩飞等改良６－ＯＨＤＡ注射法建立早期帕金森病大鼠模型 ｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）ｉｎ ｓｕｂ— ｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｃｏｍｐａｃｔａ（ＳＮｃ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｙｌｉｎｄｅｒ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｆｏｒｅ－ ｌｉｍｂ ｉｎ ｇｒｏｕｐ ＰＤ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｃ（Ｐ＜０．０１）．Ｒｏｔａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｕｒｎｓ ｉｎ ｇｒｏｕｐ ＰＤ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ３．４８ ｔｕｒｎｓ／ｍｉｎ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｃ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ ＰＤ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ８９．６６％．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｈｏｗｅｄ ＴＨ ｐｏｓｉ— ｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｆｉｇｈｔ ＳＮｃ ｏｆ ＰＤ ｍｏｄｅｌ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｂｏｕｔ ４４．８１％ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｇｒｏｕｐ Ｃ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ＰＤ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ６一ＯＨ— ＤＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｓｉｍｐｌｅ，ｆｅａｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅａｒｌｙ ＰＤ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］６－Ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ；Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ｒａｔｓ；ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ；ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙ－ ｌａｓｅ 帕金森病（ｐａｒｋｉｎｓｏｎ￣ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）是中老年常 见的神经系统变性疾病，以中脑黑质致密部（ｓｕｂ－ ｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｃｏｍｐａｃｔａ，ＳＮｃ）的多巴胺（ｄｏｐａｍｉｎｅ， 酸（Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、阿扑吗啡（Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ， ＡＰＯ）均为美国ｓｉｇｍａ公司生产，ＤＡＢ、ＡＢＣ试剂均 为美国Ｖｅｃｔｏｒ公司生产。 １．２方法 ＤＡ）能神经元进行性变性、缺失以及纹状体内ＤＡ 水平下降、黑质及蓝斑出现路易小体（１ｅｗｙ ｂｏｄｙ） 为主要病理特征¨－２］。ＰＤ临床主要表现为静止性 震颤、运动迟缓、肌僵直、姿势平衡障碍等运动症 状，严重影响了患者及其家属生活质量 Ｊ。为了 达到早期诊断、预防和治疗的目的，国内外对ＰＤ １．２．１模型制备与分组大鼠自由摄食及饮水， 适应性饲养１周后，４Ｏ只ＳＤ大鼠随机分为ｃｏｎｔｒｏｌ 组１０只，ＰＤ组３０只。于造模手术前３０ ｍｉｎ，腹腔 注射地昔帕明（２５ ｍｇ／ｋｇ）及帕吉林（５ ｍｇ／ｋｇ），常 规麻醉。将大鼠头部固定于立体定位仪上，切开头 皮及皮下组织，钝性分离颅骨外膜，充分暴露前囟。 以前囟为中心，根据Ｐａｘｉｎｏｓ和Ｗａｔｓｏｎ＿６ 大鼠立体 定位图谱定位（Ａ／Ｐ １．０ ｍｍ，Ｌ／Ｎ ３．０ ｍｍ，Ｄ／Ｖ ５．０ ｍｍ），进针（１ ｍｍ／ｍｉｎ）入右侧纹状体。ｃｏｎｔｒｏｌ 发病机制的研究重点已经从晚期转移到发病早 期 Ｊ，但迄今为止，ＰＤ病因及发病机制尚不明确， 亦无令人满意的治疗方案。动物模型是ＰＤ基础 研究的重要材料，目前主要有６一羟基多巴胺（６一 Ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ，６一ＯＨＤＡ）模型、１一甲基４－苯基－１， ２，３，６一四氢吡啶（１一ｍｅｔｈｙｌ４一ｐｈｅｎｙｌ １，２，３，６－ｔｅｔｒａ— ｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）模型、百草枯模型及鱼藤酮 组注射抗坏血酸溶液４ Ｌ（称取２ ｍｇ抗坏血酸溶 于１０ ｍＬ生理盐水），ＰＤ组注射６－ＯＨＤＡ溶液 ４ Ｌ（称取５ ｍｇ的６－ＯＨＤＡ溶于１ ｍＬ抗坏血酸溶 液）。使用微量进样器以０．４ Ｉ￣Ｌ／ｍｉｎ匀速注入，注 射完成后留针５ ｒａｉｎ再缓慢退针（１ ｍｍ／ｍｉｎ）。明 模型等，各种建模方法均各有优缺点，但成模率均 不够高 ｊ。因此，本研究在原有ＰＤ大鼠模型基础 上，采用辅助药物地昔帕明（ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ）、帕吉林 （ｐａｒｇｙｌｉｎｅ）对立体定位注射造模方法加以改进，并 通过行为学检测及免疫组织化学评价模型效果，为 胶海绵填充颅骨孔，局部消毒缝合头皮，连续７ Ｄ 每天腹腔注射２０万单位青霉素以预防感染。ｃｏｎ— ｔｒｏｌ组无死亡，３Ｏ只ｍｏｄｅｌ组大鼠中有１例死亡。 早期ＰＤ动物模型建立及其机制研究提供一定的 方法依据。 １．２．２圆筒测试术后第３、４周，采用圆筒测试 方法检测大鼠前肢使用不对称性。将大鼠置于透 明玻璃圆筒中（直径１７ ｃｍ，高度２７ ｃｍ），在圆筒后 放置一面镜子以便于观察其背对摄像头时前肢使 用情况。待５ ｍｉｎ后大鼠适应圆筒里的环境开始 计时５ ｒａｉｎ，记录其每次站立时左、右、双侧前肢分 别接触筒壁的次数 。按公式：（左＋０．５ Ｘ双 １材料与方法 １．１材料 健康雄性ｓＤ大鼠４０只，体重２５０—３００ ｇ，贵 州医科大学动物实验中心提供。蓝星脑立体定位 仪（淮北正华生物仪器设备有限公司）、石蜡切片 机（Ｌｅｉｃａ，德国）、正置荧光显微镜（Ｎｉｋｏｎ，Ｅｔ本）， 酪氨酸羟化酶（（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ＴＨ）抗体（博 士德，中国），６－ＯＨＤＡ、地昔帕明、帕吉林、抗坏血 侧）／（左侧＋右侧＋双侧）×１００，计算各组大鼠左 前肢使用率。 １．２．３旋转测试通过腹腔注射ＡＰＯ诱发ＰＤ大 鼠的旋转行为。术后第３、４周，将大鼠放置于圆柱 形盒子（直径２４０ ｍｍ，高３００ ｍｍ）中，以非选择性 ２５９ 贵州医科大学学报 ４２卷 ＤＡ受体激动剂ＡＰＯ（０．１％，溶于生理盐水）腹腔 注射（２ ｍｇ／ｋｇ），诱发大鼠向健侧（左侧）旋转行 为。摄像机连续记录６０ ｍｉｎ，计算大鼠向左侧旋的 平均速度，以发生旋转作为模型成功标准 ｊ。 ４周ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。 见图２。 盈ｃｏｎｔｒｏｌ 圜ｍｏｄｅｌ ／一、 １．２．４免疫组化检测ＳＮｃ部位ＴＨ阳性神经元数 量ＤＡ神经元主要集中在ＳＮｃ部位，ＴＨ在ＤＡ神 经元胞浆内表达呈棕黄色。术后第４周，随机取 、＿／ 旺 ｃｏｎｔｒｏｌ组及ｍｏｄｅｌ组各１０只大鼠，用１０％水合氯 醛腹腔注射麻醉后迅速剪开胸腹腔暴露心脏，持留 置针从心尖部插入左心室并剪开右心耳，迅速灌注 生理盐水至肝脏变白，再灌注含４％多聚甲醛的磷 酸缓冲液（ＰＢ）２５０ ｍＬ进行固定后取脑，置于上述 相同固定液中再固定２４ ｈ，酒精梯度脱水、石蜡包 埋，在中脑黑质区以４ ｍ的厚度连续切片。切片 经脱蜡、１％过氧化氢孵育、漂洗以及微波小火抗原 修复，再以１０％山羊血清封闭１ ｈ后滴加ＴＨ抗体 （１：２００）４℃孵育过夜。按ＳＡＢＣ免疫组织化学试 剂盒说明孵育二抗及ＡＢＣ。切片经ＤＡＢ显色 １ ｍｉｎ后梯度脱水透明后中性树胶封片，并在正置 显微镜下观察并拍照，每只大鼠随机选取５张切 片，每张切片随机选取４个视野，在同一放大倍数 （４０×，４００×），同一背景光强度下采集图像，采用 Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．０图像分析软件对各组大鼠ＳＮｃ 部位的ＴＨ阳性细胞计数。 １．３统计学分析 采用ＳＰＳＳ ２２．０统计软件分析数据，计量资料 以均数±标准差（ｘ± ）表示，两组数据比较采用ｔ 检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２ 结果 ２．１左前肢使用率 术后第３周和第４周时，ｍｏｄｅｌ组左前肢使用 率与ｃｏｎｔｒｏｌ组相比均明显减少，差异有统计学意 义（Ｐ＜０．０１），ｍｏｄｅｌ组第３周与第４周左前肢使 用率比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），见图１。 ２．２平均旋转速度 ＡＰＯ注射３～５ ｍｉｎ后大鼠开始出现肢体僵 直，随即出现以健侧后肢（左后肢）为支点的旋转 行为，首尾相接，身体弯曲成环状。术后第３周 ｍｏｄｅｌ组７５．８６％（２２只）发生旋转，平均旋转速度为 （２．Ｏ１±０．２３）圈／ｍｉｎ，高于ｃｏｎｔｒｏｌ组（Ｐ＜０．Ｏ１）。 术后第４周ｍｏｄｅｌ组８９．６６％（２６只）发生旋转，发 生旋转平均旋转速度为（３．４８±０．４０）圈／ｍｉｎ，与第 ２６０ 嫠 淀 ”’与ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，Ｐ＜０．０１； 图１ 术后第３、４周大鼠左前肢使用率 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｐａｗ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ３ ａｎｄ ４ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ ２．３ ＳＮｃ部位ＴＨ阳性神经元 术后第４周，ｃｏｎｔｒｏｌ组大鼠右侧ＳＮｃ部位ＴＨ 呈阳性表达，ＤＡ神经元胞核轮廓清晰可见，胞体 附近围绕大量神经纤维束（图３Ａ）；ｍｏｄｅｌ组右侧 ＳＮｃ部位ＴＨ阳性细胞明显减少或缺失，残存的细 胞萎缩且突触减少，提示该区域内的ＤＡ能神经元 变性坏死（图３Ｂ）。Ｉｍａｇｅ—Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．０分析显示， ｍｏｄｅｌ组右侧ＳＮｃ部位ＴＨ阳性神经元数目较ｃｏｎ． ｔｒｏｌ组右侧减少（４４．８１±２．８９）％，差异有统计学 意义（Ｐ＜０．０１）。见图３。 ３讨论 ＰＤ为继阿尔茨海默病后第２个常见的神经退 行性疾病，６５岁以上的人群发病率为１％～２％［８ ３。 ＰＤ的研究一直备受关注，而该病病因及机制不清 楚导致ＰＤ相关的早期神经保护药物的开发研究 难以突破。动物模型是研究ＰＤ发病机制不可或 缺的工具，因此，如何高效制备与ＰＤ患者病理相 似的实验动物模型成为关键所在。应用６一ＯＨＤＡ 建立ＰＤ大鼠模型具有动物体积较大，造模操作易 控制，动物行为持续时间长等优势，且ＡＰＯ诱发 ＰＤ大鼠向健侧旋转的圈数与黑质纹状体通路中 ＤＡ能神经元毁损量呈正相关可对模型损伤程度 进行量化评价 』，因此，６．ＯＨＤＡ制备ＰＤ大鼠模 型被研究ＰＤ发病机制的学者们广泛应用 １０］。６一 ＯＨＤＡ是神经递质ＤＡ的羟基化衍生物，可以高选 择地引起交感肾上腺素能神经末梢急性溃变。研 究显示，６－ＯＨＤＡ经单胺氧化酶氧化生成的神经毒 性物质能阻滞黑质线粒体呼吸链，导致氧化应激增 ３期 韩 飞等改良６．ＯＨＤＡ注射法建立早期帕金森病大鼠模型 此，ＴＨ免疫组化染色能够反应黑质ＤＡ能神经元 数 。地昔帕明可减少６ ＯＨＤＡ引起的去肾上 强，使ＤＡ能神经元选择性缺失 。此外，６．ＯＨ— ＤＡ注射入纹状体引发的病理变化更接近人类的 ＰＤ发病过程，避免了６一ＯＨＤＡ直接注射到黑质所 一。一ｕＪ，匝一蓦『 寺毒 ５ ４ ３ ２ ● ０ 腺素和单胺氧化酶抑制剂５ＨＴ的损耗，帕吉林能 通过减少突触对６－ＯＨＤＡ的分解，加强ＤＡ能神经 引起的过度氧化应激 ，因此６－ＯＨＤＡ注射入 纹状体构建ＰＤ模型是ＰＤ机制研究的首选。ＴＨ 是脑内ＤＡ能神经元特有的ＤＡ合成限速酶，因 目元对６一ＯＨＤＡ的敏感性，两药物连用可以提高６一 ＯＨＤＡ有效性和选择性。。 。 ｃｏｎｔｒｏｌ 口ｍｏｄｅｌ ＰＤ组大鼠旋转行为 …与ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，Ｐ＜０．０１ 图２ 术后第３、４周ＡＰＯ注射后大鼠的旋转行为 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ３ ａｎｄ ４ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ（ＡＰＯ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｏｔａｔｉｏｎｓ） 一ｌ０ｏ 一一 ｂ 导５０ ０ Ⅱ 注：Ｉ为ＴＨ阳性细胞数目柱状图， 与ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，Ｐ＜０．０１；１１为免疫组化图片，ａ表示ｃｏｎｔｒｏｌ组右侧 ＳＮｃ部位（４０×），ｂ表示ｍｏｄｅｌ组右侧ＳＮｃ部位（４０×），Ａ、Ｂ为ａ、ｂ方框位置图片的放大（４００×） 图３ 两组大鼠ＳＮｃ部位ＴＨ的表达 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＨ ｉｎ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｅｏｍｐａｃｔａ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐｓ 行为学改变是评判早期ＰＤ模型的重要指标。 本次研究中，由于动物个体差异较大，为使行为学 数据更准确，建立了较多模型大鼠。实验中观察到 ｍｏｄｅｌ组大鼠第３、４周由于右侧大脑纹状体损伤 与Ｄｅｅｒｅｓｓａｅ Ｍ等 ｊ报道的６－ＯＨＤＡ注射人纹状体 后旋转速度（约３圈／ｍｉｎ）相符合。有研究报道， 早期ＰＤ模型成功率低（约为３０％），本文的方法 突出之处为模型成功率高，虽６一ＯＨＤＡ剂量相对较 高，可通过降低剂量从而减轻ＰＤ病变程度，这必 导致旋转速率减小，但早期ＰＤ模型旋转速率约 （１—２）圈／ｍｉｎｌ１９］，因此，降低剂量使得更符合早期 ＰＤ病变标准 ２０Ｉ。因此，本研究表明，在地昔帕 明、帕吉林药物辅助下，有望通过减少６一ＯＨＤＡ剂 量从而提高早期ＰＤ模型成模率。此外，有研究显 ２６ｌ 导致左前肢使用百分比均明显减少。经ＡＰＯ诱 导，ｍｏｄｅｌ组在大鼠术后第３周７５．８６％表现出不 对称的旋转行为（平均旋转速度为２．Ｏ１圈／ｍｉｎ）， 第４周８９．６６％模型发生不对称旋转行为，且不对 称行为加重（平均旋转速度为３．４８圈／ｍｉｎ），间接 反应了ＤＡ能神经元逐渐减少的进行性病变特征。 贵州医科大学学报 ４２卷 示，ＳＮｃ约４０％的ＤＡ能神经元丢失时，ＰＤ动物 的某些运动症状开始逐渐显现，类似于临床早期 ＰＤ患者黑质一纹状体通路的部分损伤 。本次 建模方法通过ＴＨ免疫组织化学染色显示，ｍｏｄｅｌ 组右侧ＳＮｃ部位ＴＨ阳性神经元数目较ｃｏｎｔｒｏｌ组 右侧减少（４４．８１±２．８９）％，即ＤＡ能神经元减少 约４４．８１％，较早期ＰＤ神经元减少稍多，类似旋转 实验结果，进一步表明在地昔帕明、帕吉林药物辅 助下，通过减少６－ＯＨＤＡ剂量建立早期ＰＤ模型， 可使模型成功率大大提高。 综上所述，本研究通过药物地昔帕明、帕吉林 辅助制备的早期ＰＤ大鼠模型，经圆筒试验及旋转 试验行为学检测、黑质ＴＨ阳性神经元数量旁证了 该法可以有效提高早期ＰＤ的模型成功率，为早期 ＰＤ动物模型建立及机制研究提供了一定方法依据。 ４参考文献 ［１］Ｄａｕｅｒ Ｗ，Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ Ｓ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｓ．［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｎ，２００３（６）：８８９—９０９． ［２］孙倩，陈伟，陈生弟．帕金森病早期诊断的生物学标志 物［Ｊ］．中国现代神经疾病志，２０１３（８）：６６７—６７２． ［３］Ｋｉｒｉｋ Ｄ，Ｒｏｓｅｎｂｌａｄ Ｃ，Ｓｊｔｉｒｋｌｕｎｄ Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎ— ｔｒａｓｔｒｉａｔａｌ ６一ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉ— ｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９８（２）：２５９—２７７． ［４］Ｓｅｇｕｒａ—Ａｇｕｉｌａｒ Ｊ，Ｐａｒｉｓ Ｉ，Ｍｕｏｚ Ｐ．Ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ『Ｊ］．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１６ （７）：１３８１—１３８２． ［５］Ｊａｇｍａｇ ＳＡ，Ｔｒｉｐａｔｈｉ Ｎ，Ｓｈｕｋｌａ ＳＤ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏ— ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６（９２）：５０３． ［６］Ｐａｘｉｎｏｓ Ｇ，Ｗａｔｓｏｎ ＣＲ．Ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｃｏｏｒ． ｄｉｎａｔｅｓ［Ｍ］．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．１９８６：６ ［７］Ｄｅｃｒｅｓｓａｃ Ｍ，Ｍａｔｔｓｓｏｎ Ｂ，Ｂｊ０ｒｋｌｕｎｄ Ａ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ６一 ＯＨＤＡ ａｎｄ ｏｔ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０１２（１）：３０６—３１５． ［８］Ｅｌｂａｚ Ａ，Ｃａｒｃａｉｌｌｏｎ Ｌ，Ｋａｂ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ．［Ｊ］．Ｒｅｖｕｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｑｕｅ，２０１ ５（１— ２）：１２９—１５１． ［９］Ｇｒｅａｌｉｓｈ Ｓ，Ｍａｔｔｓｓｏｎ Ｂ，Ｄｒａｘｌｅｒ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓａｔｉ． ｏｎ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｎｉｇｒａｌ ６一ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ２６２ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｅｉｅｎｃｅ，２０１０（１２）：２２６６—２２７８． ［１０］李进，孙杰，赵楠，等．３种不同脑区定点注射６一ＯＨ— ＤＡ单侧损伤大鼠帕金森病模型的比较研究［Ｊ］．河 北医科大学学报，２０１６（６）：６６７—６７１． ［１１］Ｓｉｍｏｌａ Ｎ，Ｍｏｒｅｌｌｉ Ｍ，Ｃａｒｔａ ＡＲ．Ｔｈｅ ６一Ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍ— ｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｒｅ— ｓｅａｒｃｈ，２００７（３—４）：１５１—１６７． ［１２］Ａｃｔｏｎ ＰＤ，Ｍｏｚｌｅｙ ＰＤ．Ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏ— ｇｒａｐｈｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．［Ｊ］． Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０００（１—２）：１１—２７． 『１３］Ｔｏｂ６ｎ—Ｖｅｌａｓｃｏ ＪＣ，Ｌｉｍ６ｎ—Ｐａｃｈｅｃｏ ＪＨ，Ｏｒｏｚｃｏ— Ｉｂａｒｒａ Ｍ，ｅｔ ａ１．６一ＯＨＤＡ—ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｍｉｔｏ— ｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｒｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｅａｒｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｒｆ２ ａｎｄ ＮＦ—ＫＢ ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１３（３０４）：１０９—１１９． ［１４］Ｆｒａｎｃａｒｄｏ Ｖ，Ｒｅｃｃｈｉａ Ａ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ｌ——ＤＯＰＡ ｉｎ ｔｈｅ ６—— ｈｙｄｒ０ｘｙｄ０ｐａｍｉｎｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１１（３）：３２７—３４０． ［１５］Ｉｃｈｉｔａｎｉ Ｙ，Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ，Ｎａｋａｈａｒａ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｓｔｒｉａｔａｌ ６——ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｄｏ－— ｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎ ｓｙｓｔｅｍ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂ— ｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９４（２）：２６９ —２７８． ［１６］Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｓｅｈａｌｌｅｒｔ ＳＭＦＪ．ＣＮＳ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｒｅｌｉｍｂ ｓｅｎｓｏｒｉｍｏｔｏｒ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｓｔｒｏｋｅ，ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｂｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ２０００（５）：７７７—７８７． ［１７］Ｈｅｎｒｙ Ｂ，Ｃｒｏｓｓｍａｎ ＡＲ，Ｂｒｏｔｃｈｉｅ ＪＭ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｏｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ０ｆ Ｌ—ｄｏｐａ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ．［Ｊ］．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕ— ｒｏｌｏｇｙ，１９９８（３）：５３—６１． ［１８］Ｔｈｉｅｌｅ ＳＬ，Ｗａｒｒｅ Ｒ，Ｎａｓｈ ＪＥ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｕｎｉｌａｔ— ｅｒａｌｌｙ—ｌｅｓｉｏｎｅｄ ６一ＯＨＤＡ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，２０１２ （６０）：３２３４—３２３４． ［１９］王修敏．大鼠早期帕金森病模型的初建与评价［Ｄ］． 温州医学院，２０１１． ［２０］Ｔｍｏｎｇ Ｌ，Ａｌｌｂｕｔｔ Ｈ，Ｋａｓｓｉｏｕ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｅ— ｈａｖｉｏｕｒ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｇｒａｄｅｄ ６－ＯＨＤＡ ｌｅｓｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｅｈａｖ— ｉｏｕｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６（１）：１—９． （２０１７－－０１—１２收稿，２０１７＿０２－２８修回） 中文编辑：文箐颍；英文编辑：苏晓庆