犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111514288 A(43)申请公布日 2020.08.11

(21)申请号 202010406017.2(22)申请日 2020.05.14

(71)申请人 常州同泰生物药业科技股份有限公

司

地址 213000 江苏省常州市新北区罗溪镇

空港产业园盛达路19号(72)发明人 何青　张彧　刘维全　(74)专利代理机构 常州兴瑞专利代理事务所

(普通合伙) 32308

代理人 张秋月(51)Int.Cl.

A61K 39/175(2006.01)A61K 39/23(2006.01)A61P 31/14(2006.01)

权利要求书2页 说明书11页

CN 111514288 A(54)发明名称

犬细小二联灭活疫苗的制备方法犬瘟热、

(57)摘要

本发明公开了一种犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，方法步骤中包含：病毒液制备，将犬瘟热病毒毒种接种于单层Vero细胞，细胞病变达80%时收获病毒液，反复冻融，得到犬瘟热病毒液；将犬细小病毒毒种接种于F81细胞，细胞病变达90%以上时收获病毒液，反复冻融，得到犬细小病毒液；病毒灭活，往犬瘟热病毒液中加入甲醛溶液以进行灭活，得到犬瘟热病毒灭活液；往犬细小病毒液中加入甲醛溶液以进行灭活，得到犬细小病毒灭活液；配苗，将犬瘟热病毒灭活液和犬细小病毒灭活液按照（1~2）：1的体积比例混合，得到混合液，再加入氢氧化铝，得到二联灭活疫苗。采用本发明中的方法所制备的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的效力优异、稳定，免疫效果好。

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权　利　要　求　书

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1.一种犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，方法步骤中包含：病毒液制备，将犬瘟热病毒毒种接种于单层Vero细胞，细胞病变达80%时收获病毒液，反复冻融，得到犬瘟热病毒液；将犬细小病毒毒种接种于F81细胞，细胞病变达90%以上时收获病毒液，反复冻融，得到犬细小病毒液；

病毒灭活，往犬瘟热病毒液中加入甲醛溶液以进行灭活，得到犬瘟热病毒灭活液；往犬细小病毒液中加入甲醛溶液以进行灭活，得到犬细小病毒灭活液；

配苗，将犬瘟热病毒灭活液和犬细小病毒灭活液按照（1~2）：1的体积比例混合，得到混合液，再加入氢氧化铝，得到二联灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述犬瘟热病毒毒种为犬瘟热病毒CDV-L株生产种子批第11代毒种；

和/或所述犬细小病毒毒种为犬细小病毒CPV-L株生产种子批第10代毒种。3.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述Vero细胞为Vero工作细胞库第25代细胞；和/或所述F81细胞为F81细胞库第25代细胞。4.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在病毒液制备的过程中，将体积浓度为2~3%的犬瘟热病毒毒种液接种于单层Vero细胞；和/或将体积浓度为1~2%的犬细小病毒毒种液接种于F81细胞。5.根据权利要求4所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在病毒液制备的过程中，将犬瘟热病毒毒种接种于单层Vero细胞后，在35℃的条件下培养4~5日，细胞病变达80%时收获病毒液，反复冻融3次后，过滤去除细胞碎片，得到犬瘟热病毒液；

和/或将犬细小病毒毒种接种于F81细胞后，在37℃的条件下培养过夜，更换细胞维持液，37℃下继续培养5天，细胞病变达90%以上时收获病毒液，反复冻融3次后，过滤去除细胞碎片，得到犬细小病毒液。

6.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在病毒灭活的过程中，往犬瘟病毒液中加入甲醛溶液，配置成甲醛的体积浓度为0.1%的病毒液，将该病毒液置于4℃的环境下至少24h，期间多次混匀，得到犬瘟热病毒灭活液；

和/或往犬细小病毒液中加入甲醛溶液，配置成甲醛的体积浓度为0.4%的病毒液，将该病毒液置于37℃的环境下至少48h，期间多次混匀，得到犬细小病毒灭活液。

7.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，犬瘟热病毒液的毒价≥105.3 TCID50/ml；犬细小病毒液的毒价≥106.0 TCID50/ml。8.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，二联灭活疫苗中，氢氧化铝的含量为600~1000 μg/ml。9.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，犬瘟热病毒灭活液分别按照100、10-1、10-2稀释后，分别接种于单层Vero细胞，接种量为Vero细胞的细胞培养液体积的3%，分别置35℃、5% CO2培养箱中培养观察，连传3代，无CPE产生；

犬细小病毒灭活液分别按照100、10-1、10-2稀释后，分别接种于F81细胞，接种量为F81细

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胞的细胞培养液体积的2%，分别置37℃、5% CO2培养箱中培养观察，连传3代，无CPE产生。

10.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，犬瘟热病毒液和犬细小病毒液的保存温度为-20℃；

犬瘟热病毒灭活液和犬细小病毒灭活液的保存温度为2~8℃。

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犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法

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技术领域

[0001]本发明涉及一种犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法。

背景技术

[0002]犬的用途很广，可作为实验犬、军犬、警犬、宠物犬等，但死于犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的概率很高，特别是在幼时，且这两种病毒在犬类之间具有传染性，一旦感染，往往花费甚多却收效甚微，目前市场的犬瘟热、犬细小灭活疫苗质量不稳定，往往存在着免疫失效、免疫时间短、不良反应多等缺陷。发明内容

[0003]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，采用本发明中的方法所制备的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的效力优异、稳定，免疫效果好。

[0004]为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗的制备方法，方法步骤中包含：[0005]病毒液制备，将犬瘟热病毒毒种接种于单层Vero细胞，细胞病变达80％时收获病毒液，反复冻融，得到犬瘟热病毒液；将犬细小病毒毒种接种于F81细胞，细胞病变达90％以上时收获病毒液，反复冻融，得到犬细小病毒液；[0006]病毒灭活，往犬瘟热病毒液中加入甲醛溶液以进行灭活，得到犬瘟热病毒灭活液；往犬细小病毒液中加入甲醛溶液以进行灭活，得到犬细小病毒灭活液；[0007]配苗，将犬瘟热病毒灭活液和犬细小病毒灭活液按照(1～2)：1的体积比例混合，得到混合液，再加入氢氧化铝，得到二联灭活疫苗。[0008]进一步，所述犬瘟热病毒毒种为犬瘟热病毒CDV-L株生产种子批第11代毒种；[0009]和/或所述犬细小病毒毒种为犬细小病毒CPV-L株生产种子批第10代毒种。[0010]进一步，所述Vero细胞为Vero工作细胞库第25代细胞；[0011]和/或所述F81细胞为F81细胞库第25代细胞。[0012]进一步，在病毒液制备的过程中，将体积浓度为2～3％的犬瘟热病毒毒种液接种于单层Vero细胞；和/或将体积浓度为1～2％的犬细小病毒毒种液接种于F81细胞。[0013]进一步，在病毒液制备的过程中，将犬瘟热病毒毒种接种于单层Vero细胞后，在35℃的条件下培养4～5日，细胞病变达80％时收获病毒液，反复冻融3次后，过滤去除细胞碎片，得到犬瘟热病毒液；[0014]和/或将犬细小病毒毒种接种于F81细胞后，在37℃的条件下培养过夜，更换细胞维持液，37℃下继续培养5天，细胞病变达90％以上时收获病毒液，反复冻融3次后，过滤去除细胞碎片，得到犬细小病毒液。[0015]进一步，在病毒灭活的过程中，往犬瘟病毒液中加入甲醛溶液，配置成甲醛的体积浓度为0.1％的病毒液，将该病毒液置于4℃的环境下至少24h，期间多次混匀，得到犬瘟热

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病毒灭活液；[0016]和/或往犬细小病毒液中加入甲醛溶液，配置成甲醛的体积浓度为0.4％的病毒液，将该病毒液置于37℃的环境下至少48h，期间多次混匀，得到犬细小病毒灭活液。[0017]进一步，犬瘟热病毒液的毒价≥105.3TCID50/ml；犬细小病毒液的毒价≥106.0TCID50/ml。[0018]进一步，二联灭活疫苗中，氢氧化铝的含量为600～1000μg/ml。[0019]进一步，犬瘟热病毒灭活液分别按照100、10-1、10-2稀释后，分别接种于单层Vero细胞，接种量为Vero细胞的细胞培养液体积的3％，分别置35℃、5％CO2培养箱中培养观察，连传3代，无CPE产生；

[0020]犬细小病毒灭活液分别按照100、10-1、10-2稀释后，分别接种于F81细胞，接种量为F81细胞的细胞培养液体积的2％，分别置37℃、5％CO2培养箱中培养观察，连传3代，无CPE产生。

[0021]进一步，犬瘟热病毒液和犬细小病毒液的保存温度为-20℃；犬瘟热病毒灭活液和犬细小病毒灭活液的保存温度为2～8℃。[0022]采用了上述技术方案后，采用本发明中的制备方法所制备的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗效力优异、稳定，犬类在接种后，无任何不良反应，且免疫效果好，犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗集犬瘟热疫苗和犬细小疫苗为一体，犬只需接种一针，就可同时对犬瘟热病毒和犬细小病毒免疫，且本发明中的制备方法简单。具体实施方式

[0023]为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例，对本发明作进一步详细的说明。[0024]1材料

[0025]1.1生产用毒种

[0026]采用犬瘟热病毒CDV-L株生产种子批第11代毒种，采用犬细小病毒CPV-L株生产种子批第10代毒种。

[0027]1.2Vero细胞、F81细胞

[0028]Vero细胞采用Vero工作细胞库第25代细胞；[0029]F81细胞采用F81工作细胞库第25代细胞。[0030]1.3原辅材料

[0031]细胞培养液DMEM购自北京天信和生物科技有限公司，新生牛血清购自武汉三利生物技术有限公司，胰蛋白酶购自Gibco公司，管制玻璃瓶购自兆丰(丹阳)新型药用包材有限公司，丁基胶塞购自江阴伟涵玻璃制品厂，铝塑组合盖购自靖江市焱鑫包装材料有限公司。[0032]细胞生长液：按体积百分比计，包含10％的新生牛血清和90％的细胞培养液；[0033]细胞维持液：按体积百分比计，包含2％的新生牛血清和98％的细胞培养液。[0034]1.4佐剂

[0035]氢氧化铝佐剂，购自吉林正业生物制品股份有限公司。[0036]2.方法

[0037]2.1制苗用病毒液的制备与检验

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2.1.1犬瘟热病毒液制备

[0039]取1瓶长至致密单层的Vero细胞，使用胰蛋白酶消化，将经胰蛋白酶消化后的Vero细胞和细胞生长液按1:3的体积比混合，分装至3瓶15L转瓶中，37℃培养。待Vero细胞长至单层，将体积浓度为2～3％的犬瘟热病毒毒种液接种于Vero细胞15L转瓶中，置35℃培养4-5日，细胞病变达80％时收获病毒液，反复冻融3次后，过滤去除细胞碎片，得到犬瘟热病毒液，犬瘟热病毒液-20℃以下保存。取样进行病毒含量测定和无菌检验。其中，犬瘟热病毒毒种液的溶剂为细胞维持液。

[0040]2.1.2犬细小病毒液制备

[0041]取1瓶长至致密单层的F81细胞，使用胰蛋白酶消化，将经胰蛋白酶消化后的F81细胞和细胞生长液按1:3的体积比混合，分装至3瓶15L转瓶中，同时将体积浓度为1～2％的犬细小病毒毒种液接种于F81细胞15L转瓶中，置37℃培养过夜，更换细胞维持液，37℃下继续培养5日，细胞病变达90％以上时收获病毒液，反复冻融3次后，过滤去除细胞碎片，得到犬细小病毒液，犬细小病毒液-20℃以下保存。取样进行病毒含量测定和无菌检验。其中，犬细小病毒毒种液的溶剂为细胞维持液。[0042]2.2灭活

[0043]2.2.1犬瘟热病毒灭活

[0044]在犬瘟热病毒液中加入甲醛溶液，配置成甲醛的体积浓度为0.1％的病毒液，置4℃，至少24小时，期间多次混匀，得到犬瘟热病毒灭活液，取样犬瘟热病毒灭活液进行灭活鉴定，犬瘟热病毒灭活液置2～8℃保存。[0045]2.2.2犬细小病毒灭活

[0046]在犬细小病毒液中加入甲醛溶液，配置成甲醛的体积浓度为0.4％的病毒液，置37℃，至少48小时，期间多次混匀，得到犬细小病毒灭活液，取样犬细小病毒灭活液进行灭活鉴定，犬细小病毒灭活液置2～8℃保存。[0047]2.3半成品检验[0048]2.3.1毒价测定

[0049]2.3.1.1犬瘟热病毒毒价测定[0050]犬瘟热病毒液按“附注1CDV病毒TCID50测定标准操作程序”进行毒价测定，≥105.3TCID50/ml。[0051]2.3.1.2 CPV病毒毒价测定[0052]灭活前病毒液按“附注2CPV病毒TCID50测定标准操作程序”进行毒价测定，≥106.0TCID50/ml。

[0053]2.3.2无菌检验[0054]按现行《中国兽药典》附录进行，为无菌生长。[0055]2.3.3灭活检验

[0056]2.3.3.1犬瘟热病毒灭活检验[0057]犬瘟热病毒灭活液，按100、10-1、10-2稀释后，分别接种于单层Vero细胞，接种量为Vero细胞的细胞培养液体积的3％，置35℃、5％CO2培养箱中培养观察，连传3代，无CPE产生。

[0058]2.3.3.2犬细小病毒灭活检验

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犬细小病毒灭活液，按100、10-1、10-2稀释后，分别接种于F81细胞，接种量为F81细

胞的细胞培养液体积的2％，置37℃、5％CO2培养箱中培养观察，连传3代，无CPE产生。[0060]2.4配苗及分装

[0061]将检验合格的犬瘟热病毒灭活液与犬细小病毒灭活液，在无菌条件下，按一定(1～2)：1的体积比混合，加入氢氧化铝(至终浓度为600～1000μg/ml)充分混匀，5ml/瓶定量分装至管制玻璃瓶，加丁基胶塞，轧铝塑组合盖，贴签。[0062]2.5成品检验[0063]2.5.1性状

[0064]混匀后为淡粉红色悬浊液。[0065]2.5.2装量[0066]按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。[0067]2.5.3无菌检验[0068]按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌生长。[0069]2.5.4甲醛含量测定[0070]按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合质量标准。[0071]2.5.5氢氧化铝含量测定[0072]用滴定法检测，在600～1000μg/ml之间。[0073]2.5.6安全检验[0074]用45～60日龄健康易感犬(CDV SN不高于1:4、CPV SN不高于1:4或HI不高于1:8)5只，每只皮下注射疫苗2头份(2ml)，观察21日。接种犬局部和全身(精神、食欲、体温与粪便等)均正常。

[0075]2.5.7效力检验下列方法任选其一。[0076]用19～21日龄健康小鼠(CDV SN不高于1:4，CPV SN不高于1:4或HI不高于1:8)5只，皮下注射疫苗0.1头份(0.1ml)/只。14日后，连同5只条件相同的对照小鼠分别采血，分离血清，检测血清中CDV SN抗体及CPV HI抗体。对照小鼠血清中CDV SN不高于1:4、CPV HI不高于1:8，免疫小鼠血清CDV SN不低于1:64、CPV HI不低于1:32，即为合格)。[0077]用45～60日龄健康易感犬(CDV SN不高于1:4，CPV SN不高于1:4或HI不高于1:8)5只，皮下注射疫苗1头份(1ml)/只。21日后，连同5只条件相同的对照犬分别采血，分离血清，检测血清中CDV SN抗体及CPV HI抗体。对照犬CDV SN不高于1:4、CPV HI不高于1:8，免疫犬血清CDV SN不低于1:64、CPV HI不低于1:32，即为合格。[0078]CDV中和抗体效价(CDV SN)按“附注3 CDV血清中和抗体测定标准操作程序”进行测定。

[0079]CPV血凝抑制效价(CPV HI)按“附注4 CPV微量血凝与血凝抑制试验标准操作程序”进行测定。

[0080]3.效力检验结果[0081]3.1小鼠试验

[0082]对所制十批次疫苗用19～21日龄健康小鼠，皮下注射疫苗0.1ml/只；对照不免疫，进行效力检验。结果均符合标准，具体结果见表1-1。[0083]表1-1 小鼠效力检验结果

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3.2犬试验

[0087]对所制十批次疫苗用45～60日龄健康易感犬，皮下注射疫苗1.0ml/只，进行效力检验，结果均符合标准，具体结果见表1-2。[0088]表1-2 犬效力检验结果

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附注1 CDV病毒TCID50测定标准操作程序

[0092]1、接种前一天将细胞传代，细胞数量尽量使细胞在第二天达到90％汇合度，最好于12～24小时间进行接毒操作。细胞于储液槽中进行吹打混匀，配制成合适的细胞密度，用移液器将细胞悬液铺到96孔板细胞培养板中，每孔加入100μl细胞悬液。将培养板放在37℃、5％CO2温箱中培养约24小时。[0093]2、病毒液于灭菌小管中作连续10倍的稀释，即用移液枪吸取100μl病毒液，加入已装有900μl DMEM液的第一个小管中，吹打混匀后，吸取100μl移入第2管装有900μl DMEM液中，吹打混匀后加入第3管。连续如此操作，形成一系列10×病毒稀释液。[0094]3、将长至单层细胞的96孔板中的完全培养基吸弃，将上述稀释好的病毒液接种入96孔板中。从病毒稀释倍数最高的病毒液开始，由高到低依次接种，每孔加入100μl病毒液，各稀释度病毒液接种8个孔。[0095]4、加入病毒液的培养板于35℃、5％CO2温箱中培养，逐日观察并记录细胞病变(CPE)情况。此过程通常需要5～7天。[0096]5、按Reed-Muench方法进行病毒滴度计算。见表附注1。

[0097]距离比例＝(大于50％的百分数-50％)/(大于50％的百分数-小于50％的百分数)

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lg TCID50＝高于50％CPE病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数以上结果求反对数即为病毒含量TCID50/0.1ml。表附注1 Reed-Muench法计算病毒滴度示例

[0101]

距离比例＝(大于50％的百分数-50％)/(大于50％的百分数-小于50％的百分数)

[0103]        ＝(88.89％-50％)/(88.89％-11.11％)[0104]        ＝0.5[0105]lg TCID50＝高于50％CPE病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数[0106]         ＝4+0.5×1[0107]         ＝4.5

[0108]以上结果求反对数即病毒含量为104.5TCID50/0.1ml。[0109]附注2 CPV病毒TCID50测定标准操作程序[0110]1、细胞生长至单层时将细胞传代，细胞于储液槽中进行吹打混匀，配制成合适的细胞密度的细胞悬液。[0111]2、病毒液于灭菌管中作连续10倍稀释，即用移液枪吸取100μl病毒液，加入已装有900μl DMEM的管中，吹打混匀，吸取100μl移入第2管装有900μl DMEM中，吹打混匀后加入第3管。连续如此操作，形成一系列10×病毒稀释液。[0112]3、每个稀释度病毒液同步接种96孔板8孔，每孔加入F81细胞悬液和病毒液各100μl，在37℃、5％CO2培养箱培养过夜，更换维持液，在同样培养条件下继续观察5日。逐日观察并记录细胞病变(CPE)情况。此过程通常需要5～7天。[0113]4、按Reed-Muench方法进行病毒滴度计算。见表附注2。

[0114]距离比例＝(大于50％的百分数-50％)/(大于50％的百分数-小于50％的百分数)[0115]lg TCID50＝高于50％CPE病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数[0116]以上结果求反对数即为病毒含量TCID50/0.1ml。[0117]表附注2 Reed-Muench法计算病毒滴度示例

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距离比例＝(大于50％的百分数-50％)/(大于50％的百分数-小于50％的百分数)

[0120]        ＝(62.5％-50％)/(62.5％-0％)[0121]        ＝0.2[0122]lg TCID50＝高于50％CPE病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数[0123]         ＝5+0.2×1[0124]         ＝5.2

[0125]以上结果求反对数即病毒含量为105.2TCID50/0.1ml。[0126]附注3CDV血清中和抗体测定标准操作程序

[0127]采用固定病毒-稀释血清终点法检测血清中的抗体效价。[0128]1、细胞：将细胞传代，接种于96孔板中。细胞数量应在24小时达90％满度为宜。病毒接种应于12～24小时间进行。[0129]2、病毒：从低温冰箱中取出病毒，融化后按其效价进行稀释，稀释成100TCID50/0.1ml。[0130]3、血清：先将待测血清置56℃水浴锅中加热灭活30分钟，以破坏补体和其他不耐热非特异性杀病毒因子。随后，将血清进行2倍连续稀释。[0131]4、感作：取定量的病毒液和等体积的不同稀释度的血清于1.5ml灭菌离心管中，移液器吹打混匀后置37℃感作1小时。[0132]5、接种：将96孔板中的细胞培养液吸弃，迅速将病毒-血清混合物或对照组的病毒或血清等接种到96孔板单层细胞中。从血清稀释倍数最低的混合液开始，由低到高依次接种，每孔加入100μl病毒-血清混合液，各稀释度混合液接种4个孔。[0133]6、将培养板置于35℃、5％CO2温箱中培养，逐日观察并记录细胞病变(CPE)情况。此过程通常需要4～5天。[0134]7、按Reed-Muench方法进行血清中抗体效价的计算。见表附注3。

[0135]距离比例＝(大于50％的百分数-50％)/(大于50％的百分数-小于50％的百分数)[0136]血清抗体效价＝高于50％保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数[0137]求以上数值的反对数，即为待检血清中和抗体效价SN。[0138]表附注3 固定病毒稀释血清法示例

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按Reed-Muench法计算，能保护50％培养细胞或实验动物的血清稀释度介于10-1.2

和10-1.8之间。距离比例＝(83-50)/(83-40)＝0.77

[0141]血清抗体效价＝高于50％保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数[0142]＝-1.2+0.77×(-0.6)[0143]＝-1.2-0.46[0144]＝-1.66

[0145]-1.66的反对数＝1/46，即1:46稀释的待检血清可保护50％的培养细胞免于出现CPE。

[0146]附注4 CPV微量血凝与血凝抑制试验标准操作程序[0147]一、材料准备[0148]1、PBS(0.015mol/L，pH6.5)[0149]母液A：0.2mol/L NaH2PO4。称取NaH2PO4 27.8g，溶于蒸馏水中，定容至1000ml。4℃贮存备用。

[0150]母液B：0.2mol/L Na2HPO4。称取Na2HPO4·7H2O 53.65g，溶于蒸馏水中，定容至1000ml。4℃贮存备用。[0151]0.015mol/L PBS(pH6.5)：取母液A 68.5ml和母液B 31.5ml相混合，用酸度计检查pH应为6.5。取该混合液75ml，加入8.5g NaCl，溶解后用蒸馏水定容至1000ml。[0152]2、1％新鲜猪红血球(含1％健康兔血清)[0153]取2～3月龄健康猪血液5～10ml，加入等量灭菌PBS混匀，1500r/min离心10分钟，取沉淀，以同样方法洗涤沉淀2次。最后，取红细胞沉淀1ml，健康兔血清(已灭活)1ml，加入98ml灭菌PBS中，混匀即可。4℃保存备用。[0154]二、微量血凝试验[0155]1、在96孔微量板上，从第1孔至第12孔或需用的倍数孔，用移液器每孔加入25μl PBS，用移液器吸取待检样品(25μl)从第1孔起依次作2倍系列稀释，至最后一个孔，弃去移液器内25μl液体(如效价较高，可预先10倍稀释)。[0156]2、每孔加入1％猪红细胞悬液25μl，并设不加待检样品的红细胞对照孔，立即在微量板振荡器上摇匀，置2～8℃40～60分钟，当对照孔中的红细胞呈明显钮扣状时判定结果。判定结果举例见表附注4-1。[0157]表附注4-1 微量血凝试验

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3、结果判定方法：以血球凝集的量为准，100％凝集判为#；75％凝集判为+++；50％

凝集判为++；25％凝集判为+；不凝集判为－。以出现++及以上者判为阳性。以阳性孔中抗原的最高稀释度作为判定终点。如以上例子中2015001号样品的血凝价(HA)为1:64。[0160]三、微量血凝抑制试验[0161]1、血凝素工作液制备[0162]1.1、血凝素凝集价测定[0163]96孔微量板法：用PBS将血凝素稀释成不同倍数，加入1％猪红细胞悬液25μl，再加入25μl PBS，在振荡器上摇匀，置2～8℃40～60分钟，当对照孔中的红细胞呈明显钮扣状时判定结果。以阳性孔的最高稀释度作为判定终点。[0164]1.2、血凝素工作液配制及检验

[0165]如果血凝素凝集价测定结果为1:1024(举例)，则4个血凝单位(即4HAU)为1024/4＝256(即1:256)。[0166]1.3、4HAU血凝素的配制[0167]取PBS 9.0ml加血凝素1.0ml，即成1:10稀释，将1:10稀释液1.0ml加入到24.6ml PBS中，使最终浓度为1:256。[0168]1.4、检验

[0169]检查4HAU的血凝价是否准确，应将配制的1:256倍稀释液分别以1.0ml的量加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0ml PBS中，使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。然后从每一稀释度中取25μl，加入PBS 25μl，再加入1％猪红细胞悬液25μl，混匀，将血凝板置2～8℃40～60分钟，如果配制的抗原液为4HAU，则1:4稀释度将给出凝集终点；如果4HAU高于4个单位，可能1:5或1:6为终点，如果较低，可能1:2或1:3为终点。应根据检验结果将血凝素稀释度做适当调整，使工作液确为4HAU。[0170]2、血凝抑制试验[0171]96孔微量板法：用PBS将被检血清作2倍系列稀释，然后每孔加入含4HAU的抗原液25μl，并设PBS和病毒对照，充分振荡后，置室温下至少30分钟或在2～8℃至少60分钟，再加入1％猪红细胞悬液25μl，置2～8℃40～60分钟，当对照孔中的红细胞呈明显钮扣状时判定结果。见表附注4-2。[0172]表附注4-2 血凝抑制试验

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3、血凝抑制结果判定方法

[0175]以血球不凝集的量为准，100％不凝集判为#；75％不凝集判为+++；50％不凝集判为++；25％不凝集判为+；凝集判为－。以出现++及以上者判为阳性。以阳性孔中血清的最高稀释度作为判定终点。如以上例子中2015005号样品的血凝抑制效价(HI)为1:64。[0176]采用本发明中的制备方法所制备的犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗效力优异、稳定，犬类在接种后，无任何不良反应，且免疫效果好，犬瘟热、犬细小二联灭活疫苗集犬瘟热疫苗和犬细小疫苗为一体，犬只需接种一针，就可同时对犬瘟热病毒和犬细小病毒免疫，且本发明中的制备方法简单。

[0177]以上所述的具体实施例，对本发明解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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