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我国乙型肝炎病毒检测技术的研究进展

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一绚囤 early clinical deterioration and 3-month outcome in the European 【8]HackeW,KasteM,FieschiC,et a1.Randomiseddouble-blindplacebo- controlled tril of tahmmbolytic therapy wih itntravenous alteplase in cooperative acute stroke study I(ECASS I)cohort[J].Stroke,1999,30 (11):2280—2284 acute ischemic stroke(ECASSII)『J].Lancet,1998,352(9136):1245. f9]FiorelliM,BastinellaoS,yonKummerR,eta1.Hemo ̄hagictransformation within 36 hours of a cerebral infarct:relationships with early clinical deterioration and 32month outcome in the European Cooperative Acute 【2]The National Institute of Neurological Disorders and Stroke 一tPA Stroke Study Group.Tissue plasminogen activator for acute isehemic stroke[J].NEugl JMed,1995,333(24):1581—1587. 【31 KummerR.Brainhemorrhageafterthrombolysis:good orbad[JJ.Stroke, Stroke Study I (ECASS I)Cohort阴.Stroke,1999,30(11): 2280—2284. 2002,33(6):1446—1447. 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(收稿日期:2010—10—19) 我国乙型肝炎病毒检测技术的研究进展 冉光义 (凌云县疾病预防控制中心,广西凌云5331 O0) 病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大,我国是病毒性乙型肝 技术、分子生物学技术和生物芯片技术,现将乙型肝炎病毒几 炎的高发流行区,普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B viers, 种检测技术作~综述。 HBV)感染率接近60%,约占世界HBV携带者的1/3t13.乙型肝 1 电子显微镜技术 炎病毒的病原体不仅具有传染性,还可能导致发展成肝硬化, 1970年英国学者Dane等在电镜下发现了完整HBV颗粒 甚至肝癌,所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝 即Danes颗粒[63,R De Vos等随后用电子显微镜观察18例 炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。随着检测技术 HBsAg阳性的慢性肝炎患者的肝组织,发现了直径约25 rim的 的不断发展,对乙型肝炎血清标记物的认识也在不断深入和更 核心抗原(HBcAg)颗粒/71。常规电镜法的优点是标本用量小,制 新。近年来,很多学者报道人群中存在HBeAg阴性的HBV携 样速度快,观察比较直观,但因其观察灵敏度较低而要求病毒 带者和抗一HBs阳性后仍存在HBV复制等情况。国内对 在标本中大量存在,该方法在日常应用中受到一定。在常 HBV—DNA和HBV的血清标记物做了相关性实验,结果表明 规基础上,科学家们将免疫化学技术与电镜术结合,形成了免 HBV—DNA的阳性率与HBeAg阳性有一致性日。同时由于HBV 疫电镜术,是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位 在复制的过程中,容易发生核苷酸的错误配对而表现出不同的 的一种方法学。胡莲美等在HBV转基因小鼠血清中发现直径 基因型,根据流行病学、生物分子学、临床医学等方面对HBV 约22 nm的球形HBsAg以及少量直径约42 rim的Danes颗 基因型的研究,HBV基因型与乙肝的临床表现、治疗、预后有着 粒 。免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高,可增加HBV的检 密切的关系,目前发现的HBV基因型分A~H 8种【引,另外 出率,但该方法的样本制备过程较复杂,对操作者的技术要求 HBsAg突变体现也成为HBV检测的又一项指标 。因此HBV 较高。 除了免疫标记物(HBsAg、抗一HBs、HBeAg、抗一HBe、抗一HBc) 2免疫学技术 外,还有HBV—DNA、基因型HBV(A~H)、抗原突变体、病毒前 免疫学检测方法主要是检测乙型肝炎病毒感染过程中产 S 抗原及其他一些标记物如HBs—IgM免疫复合物Dane颗粒 生的抗原抗体免疫标志物。常规的乙型肝炎病毒免疫标志物的 等圈,其中HBV—DNA的检测是目前准确判断乙肝病毒复制的 血清学检查为HBsAg、抗一HBs、HBeAg、抗一HBe、抗一HBc,但 重要指标。HBV病原学的检测主要是电子显微镜技术、免疫学 也有文献报道前s 抗原与HBeAg及HBV—DNA三者间有显著 作者简介:冉光义,男,42岁,大专学历,毕业于广西右江民族医学 性相关,可作为补充性免疫指标 11。免疫学检测法主要有酶免 院,主管技师。E-mail:lycdcrgy@163.com 疫分析法、放射免疫分析法和化学免疫检测法等。 基层医学论坛2011年第15卷3月上旬刊 ■鲺囤 2.1酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用 或抗原结合,洗去未结合部分,最后用 计数器测定放射性强 的检测技术,其方法简便、价廉,适合一般实验室推广,其中酶 度,从而推算出受检的抗原或抗体含量。SPRIA法灵敏度高,检 联免疫吸附技术(ELISA)目前应用最为广泛,它常用聚苯乙烯 测生物活性物质可达pg水平,比ELISA法的灵敏度高2O倍㈣。 为固相载体,使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合,然后 徐群清等 人认为用SPRIA定时测定HBV标志物可提高检出 加酶标记的抗原或抗体,再加底物显色,最后根据色泽深浅来 HBsAg的敏感度,但由于同位素稳定性差,对环境造成污染等 推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高,有效测定范围 原因,已很少用于乙肝标志物的检测。 可达到20 500 ng/mL1121,且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并 3分子生物学方法 且无放射线危害等优点。但ELISA易受外界环境和酶纯度的影 PCR方法由Saiki首先提出,由于此方法的敏感性和特异 响,林曼跃等【・31联合应用ELISA法、胶体金法和时间荧光免疫 性高,因此自20世纪9O年代初以来在我国得到广泛推广应 (TRFIA)法检测HBV标记物,弥补了上述的缺点。同时有文献 用。PCR检测技术可以在短时间内将极微弱的病毒DNA大量 报道ELISA检测HBsAg为阴性的血液用聚合酶链反应(PCR) 地扩增,从而直接检测病毒的存在,目前PCR技术在 可检出HBV—DNA,体内仍有HB ̄复制【 。因此,应当把ELISA HBV—DNA检测中已得到广泛的重视,PCR法中检测灵敏度最 技术和PCR技术联合应用于HBV的检测。 高、方法最简便、动态范围分析广泛的是实时荧光定量PCR技 微粒子酶免法(MEIA)是近年来发展起来的一种新的抗原 术。实时荧光定量PCR检测是在常规的PCR基础上添加了一 抗体检测技术,其原理是以玻璃纤维为载体,微粒子作为抗体 条标有两个荧光基团的荧光双标记探针,一个标记在探针的 或抗原的附着表面・,极大地增加了反应面积,从而提高了检测 5/端,另一个在3/端,两者构成能量传递结构,在扩增的同时 的灵敏度。由于MEIA采用最新的荧光技术,通过测定荧光强 降解杂交于扩增区域内的探针,使连接于杂交探针的荧光淬灭 度来检测被测物的浓度,而极微的荧光就能被特别的感光结构 基团和荧光发射基团分离而产生荧光,因此荧光强度的变化能 感应到,使该方法的检测灵敏度高。彭仕芳等对1 140例乙型 反映扩增产物量的变化。所谓实时是指在扩增的每一个循环中 肝炎患者血清HBV标志物用MEIA和ELISA两种方法检测旧, 均由计算机同步跟踪和直接探测扩增过程中产物量的变化,经 结果显示MEIA法检测的各种指标阳性率均高于ELISA法,其 自动化处理数据获取定量结果,不需要做扩增后产物的处理或 中两种方法检测的HBeAg和抗一HBe的阳性率差异有高度显 检测。由于是实时检测,克服了扩增产物终点检测所存在原“平 著性(P<0.01)。因此认为,MEIA法对血清HBV标志物的检出 台效应”对产物定量的影响,因而具有高度的特异性、灵敏度与 阳性率高于ELISA法。 准确性『J91。此外,由于其允许同时扩增,并在闭合的容器系统中 2.2化学免疫分析法化学发光免疫法简称CAL,是以 检测,避免了普通PCR因采用电泳检测而引起PCR产物交叉 吖啶酯(AE)及其衍生物标记抗HBs单抗,AE分子中的活化基 感染及假阳性结果的缺点。刘敬忠l圳等的研究表明应用实时 因与抗原或抗体末端氨基共价结合后,生成的标记物化学发光 PCR检测HBV—DNA不仅灵敏度、特异性较普通定性PCR高, 活性强,稳定性好。随着对化学发光法免疫检测技术的不断改 并且具有技术操作简便、自动化程度高、污染机会少等优点。 进,现在应用较多的是化学发光微粒免疫检测法(cMIA),它是 4生物芯片技术 利用磁微粒做固相载体,应用电磁场磁法分离,进一步提高分 生物芯片是近几年生命科学研究领域的一项新技术,它是 离效果,加快反应周期,达到最大发光信号峰值时间减短,灵敏 指固定基质上集成各种可以作为受体的生物信息,利用受体与 度更高。谭璐等㈣比较了CMIA和ELISA法,结果发现两者灵 连接物间的反应来进行生物学的检测。主要包括蛋白芯片和基 敏度基本相同,但CMIA检测血清乙肝标志物的自动化程度比 因芯片。 ELISA法高,并能定量检测HBsAg和抗一HBs,可动态观察疗效 蛋白芯片是将位置和结构已知的大量蛋白、多肽分子、酶、 和监测病情。 抗原、抗体按预先设计好的方式固定于滴定板、滤膜和载玻片 电化学免疫检测在原理上与化学发光检测法基本相同,只 等各种载体上组成密集的分子排列,当荧光、免疫金等标记的 是将探针固定在电极上,将化学信号转化成电信号后检测,在 靶分子与芯片上的探针分子结合后,通过一些定量检测方法对 HBV—DNA分析时,通常是将HBV—DNA探针通过自组装单分 标记信号的强度进行检测,从而判断样品中的靶分子的数量, 子层(SAM)或亲和素的方法固定在生物传感器上,用补偿DNA 达到一次实验同时检测多种生物样品的目的。基因芯片是将大 与之杂交,并选用适当的指示剂检测杂交反应程度。杨清娟 量的、特定的基因片段或寡核苷片段作为探针有序地和高密度 等 报道了一种用戊二醛将氨基修饰的寡核酸探针固定于氨 地排列固定于玻璃或膜的载体上,然后与待测有标记物的样品 基磁珠表面制成核酸传感器,用理一萘酚磷酸酯做杂交的指示 核酸近碱基配对的原则进行杂交,最后通过检测得到结果。由 剂,采用差示脉冲伏安法测定杂交的结果,成功检测了乙肝 于基因芯片可以进行大序列检测分析,具有高通量、并行、快速 HBV—DNA的片断。 等特点,在病毒学研究特别是病毒基因表达谱的研究、病毒流 2.3放射免疫检测法 固相放射免疫法(sPRIA),是利用 行病学研究等方面得到广泛的应用。Liu Dayu等[211在基因芯片 放射性同位素标记已知的抗原或抗体,使其与待测的相应抗体 上用等离子电泳富集的方法测定HBV的基因分型HBV 基层医学论坛2011年第15卷3月上旬刊 ●国囤 (A~H),分型的概率达到93%,比传统的免疫分析技术高出 6%,由于采用ITP富集的方法减少了PCR扩增的时间,本方法 的比较【J】.实用医技杂志,2008,15(3):294—295. f17]杨清娟,许丹科,姜雄平.磁珠表面核酸探针的固定及电化学方法 检测[J].分析化学,2002,30(1):56—58. 在临床诊断上有着充分的优势。 总之,随着对乙型肝炎病毒的不断深入研究,对其检测方 法的认识也越来越全面,现在临床上主要采用酶联免疫法对 HBV表面的免疫标记物进行检测和定量,但该法的特异性不 【18]徐群清,韦叶生,梁峰 IRMA法及ELISA法检测HBV五项免疫 学指标的结果分析fJ].中华实验和临床病毒学杂志,2006,24(8): 818-821. 高,且灵敏度相对较低,假阴性率高。PCR技术和生物芯片技术 已用在乙型肝炎病毒的检测中,大大提高了检测的准确度,缩 短了分析时间,实现了对HBV—DNA的定量检测,可以准确地 判断HBV病毒在体内的复制情况,但是这些检测的成本相对 【19]He ML,wu J,ChenY,et a1.A new an d sensitive method for the quamiifcation of HBV cccDNA by real—time PCR[J].Bichem Bieophys ResCommun,2002,295(5):1102—1107. [2O]刘敬忠,谭淑珍,周艳.荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒 DNA[J].中华微生物学和免疫学杂志,2001,21(6):l12—113. [21]DayuLiu,MingShi,HuaiqingHuang,eta1.Isatachophoresispreconcen— tration integrated micro fluidic chip for highly sensitive genotyping of 较高,不利于普及。因此在国内我们应尽量开展新技术的试剂 和仪器的研究,降低检测成本,扩大这些检测技术在国内的应 用范围,以准确地反映乙型肝炎病毒的复制和传染情况。 参考文献 【1]Seeger C,Mason WS.Hepatitis B virus biology【JJ.Microbiol Mol Biol Rev,2000,64(1):51—68. the hepatitis B vius[rJ].J Chromatography B,2006,844(1):32—38. (收稿日期:2010—09—25) 【2]王镜泉,郑能雄,陈杨伟.乙肝病毒DNA和血清标志物的相关性明. 职业与健康,2008,24(3):237—239. 蜱的化学免疫学及生物学 防治研究进展 黄小丽 (江西医学院上饶分院,江西上饶334000) 【3]曲人亮,李兆宏.乙肝病毒基因分型检测在临床中的重要性【J].实用 医技杂志,2oo8,15(3):328—329. [4]Carla O.Detection of HBsAg Mutants lJ]_J Med Virol,2006,78(1): 48-51. f51江秀娟,李亚琴,陈俟瑶.乙型肝炎病毒前S。抗原检测的临床意 义fJ].卫生职业教育,2008,26(2):135. f6]Dane DS,Cameron CH,Briggs M.Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis[J].Lancet, 蜱是最常见的一类动物体表寄生虫,其可侵袭鸟类、爬行 类、两栖类动物及哺乳动物,并广泛分布于世界各地。全世界已 发现800余种,计硬蜱科700多种,软蜱科150种,纳蜱科1种【lJ。 我国已记录的硬蜱科约100种,软蜱科10种。蜱不同于跳蚤和 虱,它叮在寄主身上是不会动的,它的口器不只是一根针状物, 在插入皮肤后,口器前端会在皮肤下张开,紧紧地锁住皮肤,固 定自己的身体,所以如果将蜱从皮肤上拉下来,会发现皮肤上 1970,41(7649):695—698. 【7] R De Vos,M B Ray,V J Desmet.Electron microscopy of hepatitis B viusr components in chronic active liver disease叫.J Clin Pathol, 1979.32(6):590—600. 【8】胡莲美,李秀梅,黄黎珍.复制型乙型肝炎病毒转基因小鼠血清中 病毒颗粒的免疫电镜检测『Jj.中华肝脏病杂志,2007,15(2): 145—146. 出现一个小血洞。因为蜱分泌的液体会抑制血液的凝固和传染 病毒,破坏寄主的免疫力,叮咬人体严重者若不能得到及时有 效的救治,可能导致死亡。蜱同时也是一类重要病原媒介,是出 [9] Bertoletti A,Naoumov N.Translation of jmmun0l0 cal know ledgeinte better treatments of chronichepatitis B[J]-J Hepatol,2003,39(1): 1 15—124. 血热、巴贝斯虫病和泰勒虫病等疾病的传播媒介[23。蜱在全球各 国广泛分布,并且早在一百多年前,人类就开始对蜱进行研究, 多年来许多学者一直致力于蜱的化学、免疫学及生物学防治研 究工作。现就其作一综述。 1蜱的化学防治 [10]闵福爱,王健.前S 抗原在诊断乙肝病毒复制时的临床价值 中 华医学检验杂志,2005,28(6):584—586. 【l1]窦亚玲,李永哲.乙型肝炎病毒前S。抗原检测和临床价值[JJ.中华 医学检验杂志,2006,29(8):714. 化学药物灭蜱一直以来就是控制蜱的主要方法。砷是最早 被广泛应用的杀虫剂,第二次世界大战以后,氯制剂得到广泛 应用,主要为有机氯农药(666)、有机磷农药(敌百虫、敌敌畏 [12]王浩丹,周申.生物医学标记示踪技术fM] E京:人民卫生出版社, 1995:99. 『13】林曼跃,任碧琼,朱浩稳.ELISA法、胶体金法和TRFIA法联合检 测HBVM的评价『J1.中国误诊学杂志,2008,8(10):2331—2332. 等)、有机氮农药(塔克蒂克、氨丙啉等)等。然而,由于这些化学 药物使用不当,使其在一些地区已产生耐药性虫株,致使常规 剂量防治效果不理想,而要依靠加大药物量来维持效果,也致 使在畜产品及周围环境中药物残留日趋严重,并由此给环境公 共卫生带来问题。目前各国多采用拟除虫菊酯类化合物和抗生 作者简介:黄小丽,女,26岁,本科学历,毕业于重庆医科大学,助 教。E—mail:wm667788@163.corn 【14]李伟,李峰生,陈舒.乙肝病毒血清标记物与血清HBV—DNA的关 系们.细胞与分子免疫学杂志,2005,24(8):818—821. 【15]彭仕芳,傅蕾,谭德明.MEIA法测定HBV血清标志物的临床应用 意义叽.中国感染控制杂志,2007,6(3):161—163. [16】谭璐.化学发光微粒子免疫分析法与酶联免疫法测定乙肝标志物 基层医学论坛2011年第15卷3月上旬刊 

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