维普资讯 http://www.cqvip.com ２００２年８月 第３９卷第４期 四川大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ａｕｇ．２００２ ＶＯ１．３９ Ｎｏ．４ 文章编号：０４９０—６７５６（２００２）０４—０７２５・０４ 精氨酸一甘氨酸一：￣ｆ－Ｉ冬氨酸三肽的合成与生物活性检测 邱 凯 ，万昌秀 ，，赵 强 ，陈 馨 ，李天全２ （１．Ｉ￣ｔ）ｑ大学高分子材料与工程系，成都６１００６５；２．Ｉ￣ｔ）ｑ大学化工学院，成都６１００６５） 摘要：在生物材料表面上先接枝精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸三肽（ 一Ｇｌｙ－Ａｓｐ，ＲＧＤ），然后再在 其上种植和培养内皮细胞，这是目前改善心血管材料血液相容性最好的方法之一．作者采用液 相合成法合成了ＲＧＤ三肽并对其进行了生物活性检测，证实用人工合成的ＲＧＤ短肽接枝后 具有促进材料与内皮细胞粘附的生物活性． 关键词：ＲＧＤ；液相合成；生物活性；内皮化 中图法分类号：Ｏ６３３．１４ 文献标识码：Ａ １ 引言 近１０年来与血液接触的生物材料表面内皮化研究已成为热点，在其材料表面引入生物活性分子已成为 提高内皮化效果的有效方法之一［ ．由于ＲＧＤ三肽是大多数整合素能识别的配体的最小氨基酸序列，在高 分子材料表面接枝人工合成的ＲＧＤ能达到让内皮细胞与之特异性结合的目的［ ．肽的合成通常有固相法． 液相法及酶促合成法．我们在实验中用液相法并证实了人工合成的ＲＧＤ三肽在材料上接枝后具有促进材 料与内皮细胞粘附的生物活性． ２实验部分 ２．１ ＲＧＤ的合成［３～６］ 用ＤＣＣ／ＨＯＢｔ液相法逐步接肽，合成路线如图１所示．用酸脱去中间体的Ｂｏｃ保护基，氢气还原脱去所 有的保护基得ＲＧＤ三肽．熔点用Ｘ一６显微熔点测定仪测定，旋光度用ＷＺＺ－１自动指示旋光仪测定，氨基酸 组成分析在日立一８３５—５０型氨基酸分析仪上测定．中间产物纯度以ＴＬＣ确定，最后产物用柱层析纯化． ２．１．１ Ｎ￣－ＮＯｅ—Ａｒｇ的制备将２ｍＬ发烟硝酸和１．２５ｍＬ ＼Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ ｌ 发烟硫酸混合物在冰盐浴中冷却，边搅拌边缓慢加入Ｌ－Ａｒｇ １．５ｇ，最后一部分精氨酸用浓硫酸冲入，混合物搅拌１ｈ，然 后倒入碎冰中，溶液先用浓氨水调节ｐＨ到８～９，然后用 冰醋酸调节到６，溶液在冰箱中保存４ｈ，收集沉淀物，用热 水重结晶，９５％的乙醇、乙醚冲洗，干燥，得产物（７０．１％， （１） 一ＯＨ Ｂ。 一ＯＨ Ｂ０ 一 （４） Ｉ ／（ （５） （２ 。。‘—ＯＨ ＮＨ２ （６） ／ ． ＇；＼ ， （７） ／ｌ ＩＩＴＩ．ｐ＝２４９．６Ｃ ２５２．１Ｃ，［ａ］｛｝＝＋１７．８６（Ｃ＝２ｍｏｌ／Ｌ， ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ），Ｒ ０．４９（正丁醇：乙酸＝１：５））． ２．１．２ ＮＯ＿Ｂｏａ－Ｎ 一Ｎ０２一Ａｒｇ的制备 将Ｎｃ－，一Ｎ０２一Ａｒｇ ２．１９ｇ（１０ｍｍｏ１）溶于１０ｍＬ ｌｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液中，加入 图１ ＲＧＤ合成路线 ２０ｍＬ四氢呋喃（Ｔ ），于冰水浴中冷却，搅拌，分次加入含叔丁氧羰基碳酸酐（Ｂｏｃ酐）２．４ｇ（１１ｍｍｏ１）的四 收稿日期：２００１—１２—１０ 基金项目：国家自然科学基金（２９８７４０２２） 作者简介：邱凯（１９７８一），男，硕士研究生． ＊通讯联系人 维普资讯 http://www.cqvip.com ７２６ 四川大学学报（自然科学版） 第３９卷 氢呋喃溶液．用氢氧化钠溶液控制ｐＨ值为９～１０．在室温下搅拌直到反应完全（ＴＬＣ跟踪，ＣＨ３Ｃ１３：ＣＨ３ＯＨ ＝４：１），冰水浴中加入乙酸乙酯２５ｍＬ，以柠檬酸酸化至ｐＨ ２－３，分液，水相用乙酸乙酯（１５ｍＬ×３）抽提，合 并乙酸乙酯层，洗涤，干燥，真空抽干，残余物（油状物）用无水乙醚析晶，乙酸乙酯和石油醚重结晶，干燥，得 到产物（７２．８％，ｍ．Ｐ＝１１０．７Ｅ～１１２．９Ｅ，［口］ ＝＋８．４６（Ｃ＝２ｍｏｌ／Ｌ，０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ），Ｒ ０．８７ （正丁醇：乙酸＝１：５））． ２．１．３ Ｂｏｃ Ｇｌｙ的制备将０．７５ｇ（１０ｍｍｏ１）甘氨酸溶于１０ｍＬ ｌｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液中，加入１０ｍＬ四氢呋 喃，于冰水浴中冷却，搅拌，分次加入含Ｂｏｃ酐２．４ｇ（１ｌｍｍｏ１）的四氢呋喃溶液．在室温下搅拌直到反应完全 （ＴＬＣ跟踪），真空抽除四氢呋喃，冰水浴中加入乙酸乙酯２５ｍＬ，以柠檬酸酸化至ｐＨ ２～３，分液，水相用乙 酸乙酯抽提（１５ｍＬ×３），合并乙酸乙酯层，饱和氯化钠溶液洗涤（１０ ｍＬ×２），无水Ｎａ２ＳＯ４干燥，真空抽干， 残余物（油状物）用无水乙醚析晶，乙酸乙酯和石油醚重结晶，干燥，得到产物．（７１．４％，ｍ．Ｐ＝８８．３＇１３～８８． ７℃，Ｒ ＝０．９２（正丁醇：乙酸＝１：５））． ２．１．４ Ａｓｐ一（ＯＢｚ１）２・ＴｏｓＯＨ的制备 将２．６６ｇ天冬氨酸（２０ｒｅｏｔｏ１），１６ｍＬ苯甲醇，７．５６ｇ对甲苯磺酸 （４４ｍｍｏ１）和４０ｍＬ苯加入２５０ｍＬ圆底烧瓶中，于１２０℃加热回流，直到无水蒸出为止，停止反应，冷却过夜． 加入３０ｍＬ乙醚和石油醚３０ｍＬ，滤取析出的晶体，用乙醇和乙醚的混合液重结晶，得到产物（８０．０％，１ＴＩ．Ｐ ＝１５２．８Ｅ，［ａ］ ＝＋１２．７８（Ｃ＝０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＴＨＦ））． ２．１．５ Ｂｏｃ Ｇｌｙ．Ａｓｐ（ＯＢｚ１）２的制备将Ｂｏｃ－Ｇｌｙ ＯＨ １．７６ｇ（１０ｒｅｏｔｏ１）溶于适量的无水四氢呋喃中，冰水浴中 加入Ｎ 羟基苯并三氮唑（ＨＯＢｔ）１．４６ｇ（１０．８ｍｍｏ１）和ＤＣＣ ２．２４ｇ（１０．８ｒｅｏｔｏ１），０Ｅ下反应２４ｈ（ＴＬＣ跟踪）， 滤除ＤＣＵ，滤液直接用于下步反应．将Ａｓｐ （ＯＢＺ１）２・ ＯＨ ４．８５ｇ（１０ｍｍｏ１）与适量的无水四氢呋喃（ＴＨＦ） 混溶，加入１．２ｇＮ 甲基吗啡啉，反应０．５ｈ（ＴＬＣ跟踪），加入上述滤液，室温下反应２４ ｈ（ＴＬＣ跟踪），常规方 法洗涤，无水硫酸钠干燥，真空抽干，得到产物（８０．４％，Ｒ严０．７８（三氯甲烷：甲醇＝３：１））． ２．１．６ ＨＣ１・ＮＨ２ Ｇｌｙ Ａｓｐ （ＯＢｚ１）２的制备将上述产物溶于４￣５ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣ１／ＥｔＯＡｃ溶液中，室温下磁力 搅拌反应２ｈ（ＴＬＣ跟踪），抽干溶液，得到粗产品．以无水乙醇重结晶，得产物（７６．４％，ｍ．Ｐ＝９４．５～９５．１＇Ｅ， Ｒ严０．８７（三氯甲烷：甲醇＝３：１））． ２．１．７ Ｎ Ｂｏｃ Ｎ￣＇＿ＮＯ２ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ（ＯＢｚ１）２的制备将Ｎ Ｂｏｃ Ｎ￣＇＿ＮＯ２ Ａｒｇ ３．１９３ｇ（１０ｍｍｏ１）溶于适量 的无水四氢呋喃中，冰水浴中加入Ｎ 羟基苯并三氮唑（ＨＯＢｔ）１．４６ｇ（１０．８ｒｅｏｔｏ１）和ＤＣＣ ２．２４ｇ（１０．８ｒｅｏｔｏ１）， ０Ｅ下反应２４ ｈ（ＴＬＣ跟踪），滤除ＤＣＵ，滤液直接用于下步反应．将ＨＣ１ＮＨ２ Ｇｌｙ．Ａｓｐ－（ＯＢｚ１）２ ４．０６８ｇ． （１０ｒｅｏｔｏ１）与适量的无水四氢呋喃（Ｔ ）混溶，加入１．２ｇ Ｎ 甲基吗啡啉，反应０．５ｈ（ＴＬＣ跟踪），加入上述滤 液，室温下反应２４ ｈ（ＴＬＣ跟踪），按照常规方法洗涤，无水硫酸钠干燥，真空抽干，得到产物（４５．０％，Ｒｆ＝ ０．３８（三氯甲烷：甲醇＝３：１））． ２．１．８ ＨＣ１・ＮＨ２ Ａｒｇ（Ｎ（３２） Ｇｌｙ Ａｓｐ（ＯＢｚ１）２的制备将上述产物溶于适量ＨＣ１／ＥｔＯＡｃ溶液中，室温下反 应２ ｈ（ＴＬＣ跟踪），石油醚析晶，无水乙醇重结晶，得到产物（７４．０％，ｍ．Ｐ＝９２．５Ｅ～９３．０Ｅ，［ａ］ ＝＋９． ２４（Ｃ＝ｌｍｏｌ／Ｌ，ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ），Ｒ严０．２１（三氯甲烷：甲醇＝３：１））． ２．１．９ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ的制备将３．３０７５ｇ（５ｍｍｏ１）ＨＣ１・ＮＨ２一Ａｒｇ（ＮＯ２）一Ｇｌｙ—Ａｓｐ（ＯＢｚ１）ＯＢｚｌ溶于适量的甲 醇溶液中，加入钯碳，于常温搅拌下通人氢气，反应３０ ｈ（ＴＬＣ跟踪）．过滤，真空抽干，得到产物（６８．０％， ［ａ］ ＝＋６．９（Ｃ＝１ｍｏｌ／Ｌ，ＣＨ３ＯＨ），Ｒ ０．４７（三氯甲烷：甲醇＝３：１））． ２．１．１０ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ的纯化采用柱层析法和薄层层析法相结合的梯度洗脱法纯化三肽． ２．２细胞培养实验 用装有ＰＢＳＡ的注射器冲洗脐带血管标本，去除血液及凝块．结扎一端，灌满胶原酶溶液，然后结扎另一 端，室温下放置１０ Ｓ．从上端结扎处剪开，收集血管内溶液，移人１０ｃｍ培养皿内．用１０ｍＬ ＰＢＳＡ冲洗内腔， 将其并收集到培养皿内的胶原酶液中．将收集到的消化液离心得到下层细胞悬液并在培养液中洗两次，每次 离心重复冲洗．收集细胞，加培养液制成细胞悬液并接种于膜片上．ＰＥＴ膜片由紫外线杀菌１５ Ｓ．取内皮细 胞在膜片上培养４ｈ，与未接枝ＲＧＤ的ＰＥＴ膜做对照，观察内皮细胞的粘附情况，结果见图２，图３． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第４期 邱凯等：精氨酸一甘氨酸一天门冬氨酸三肽的合成与生物活性检测 ７２７ 图２ ＲＧＤ接枝ＰＥＴ膜表面细胞的生长情况 图３ ＰＥＴ膜表面细胞的生长情况 ２，３ ＲＧＤ的检测 采用红外光谱对ＲＧＤ结构进行初步鉴定，与标样的Ｒ，值比较以及氨基酸分析确定产物，细胞培养实 验确定产物存在生物活性． ３结果与讨论 ３，１三肽的合成 ３，１，１合成路线的选择合成路线的选择是十分重要的，合成ＲＧＤ可以采用Ｒ—Ｇ＋Ｄ或Ｄ—Ｇ Ｒ两种 合成路线，我们采用ｃ Ｇ Ｒ合成路线是从羧基端开始，先合成ＧＤ，再合成ＲＧＤ，因为ＧＤ二肽合成相对 简单，提纯容易，对Ｇ氨基的保护也可以在较温和的条件下脱落，减少副反应的发生，最后采用催化氢化的 方法，同时脱去侧链的保护基团．由于是在中性条件下脱去保护基团，因而可以将天冬氨酸的副反应减至最 小，以提高产率并保持产物的稳定构象． ３，１，２合成方法的选择我们曾利用固相合成法尝试合成ＲＧＤ，但由于树脂粒度大，内部结构复杂以及树 脂氯含量较高，对接枝氨基酸及肽链的延长有十分明显的不良影响，并对产物的纯化、副产物的清除造成困 难，同时还将影响分析、测试的准确性，因此效果不十分理想，液相合成法是在液体环境进行短肽的合成，有 碳二亚胺、混合酸酐、活化酯等多种方法，用ＤＣＣ／ＨＯＢｔ液相法生成肽键是羧基活化形成肽键的一种，反应 时，Ｎ．保护氨基酸与ＤＣＣ物质的量的比以１：１的比例加入，Ｎ．保护氨基酸同ＤＣＣ反应生成活化中间体（）． 酰基脲，加入ＨＯＢｔ后，（）．酰基脲很快同ＨＯＢｔ反应生成ＲＣＯＯＢｔ活化酯，ＨＯＢｔ的加入，可以有效地防止Ｎ一 酰基脲的生成和抑制消旋现象的发生ｌ４Ｊ， ３，１，３溶剂的选择实验过程中，考虑到低介电常数溶剂有利于减少Ｎ．酰基脲副产物的产生，我们选择溶 解性较差的四氢呋喃为溶剂，而没有选择溶解能力较好的Ｎ，Ｎ．二甲基甲酰胺，实验得到Ｂｏｃ—Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＯＢ— ｚ１）２中间体，为了进一步生成三肽，必须先脱去Ｂｏｃ基，用无水ＨＣ１的乙酸乙酯溶液和三氟乙酸两种方法，都 能很好地脱去Ｂｏｃ基，但用ＨＣ１的乙酸乙酯溶液可以得到ＨＣ１・ＮＨ２一Ｇｌｙ—Ａｓｐ（ＯＢｚ１）２晶体，便于重结晶纯化， 而用三氟乙酸得不到晶体，所以我们选择ＨＣｌ的乙酸乙酯溶液作为脱Ｂｏｃ试剂． ３．２ ＲＧＤ的氨基酸分析 氨基酸分析结果表明，在１１．３４，１６．３２和４５．０６ ＩｎＳ处出现３个峰，分别为天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸的 吸收峰，其量的比约为１：１：１，基本上没有内缺失肽产生，达到了合成ＲＧＤ的要求．在３７．８２处出现ＮＩ％的 峰，可能是由于少量残留的保护基团的存在，由水解产生的副反应所致． ３．３生物活性检测 内皮细胞在接枝ＲＧＤ的膜片上迅速粘附，与材料结合非常紧密，在界面上形成细胞群，并且可以看出 细胞与材料形成了一些接触点，有呈放射状展开的趋势（图２）．在空白ＰＥＴ膜片上只有少量细胞生长，没有 维普资讯 http://www.cqvip.com ７２８ 四川大学学报（自然科学版） 第３９卷 形成细胞群，并有脱落现象（图３）． ４结论 以Ｌ－氨基酸为原料，采用液相法成功地合成了ＲＧＤ三肽，经硅胶柱层析后其纯度基本上能达到生物活 性纯度的要求；细胞生长试验表明，合成的ＲＧＤ肽经材料表面接枝后，同样具有促进内皮细胞粘附的生物 活性． 参考文献： ［１］Ｒｏｂｉｎ Ａ，Ｑｕｉｒｋ．Ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）．ＧＲＧＤＳ ａＳ ａ ｂｉｏｍｉｒｎｅｔｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｆｏｒ ｐｏｌｙ（Ｌａｔｉｃ ａｃｉｄ）［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｒｌａｌｓ，２００１，２２：８６５— ８７２． ［２］Ｌｅｅ Ｉ，Ｍａｒｃｈａｍ Ｒ Ｅ．Ｆｏｒｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｉｇａｎｄ（ＲＧＤ）ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｌＩｂ１３３ ｒｅ— ｃｅｐｔｏｒ ｓｙｓｔｍｅ［Ｊ］．ＳｕｒｆａｃｅＳｃｉｎｅｃｅ，２００１，４９１（３）：４３３—４４３． ［３］黄惟德，陈常庆．多肽合成［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８５．７０—７５． ［４］Ｈｏｆｍａｎｎ Ｋ，Ｐｅｅｋｈａｍ Ｗ Ｄ，Ｒｈｅｉｍｅｒ Ａ Ｊ．Ｓｔｕｄｉｅｄ ｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＶＩＩ Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｒｇｉｎｉｎｅ［Ｊ］．Ｊ． Ａｍ．ＣｈｅｍＳｏｅ，１９５７，２２：１５１５—１５２２． ［５］ＨｕｍｐｈｒｅｇＡ，Ｍｏｙｎｏｈａｍ，ＷｅｉｐｉｎｇＹｕ．Ｉｍｐｍｖｅｄ ｓｅｌｎｅｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆＬ—Ａｒｇｉｎｉｎｅ［Ｊ］．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｍｕｎｉｃｔｉｏｎ，１９９８，２８（１）： １７—２３． ［６］杨锦宗．工业有机合成基础［Ｍ］．北京：中国石化出版社，１９９８．４３． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ－ＲＧＤ ＱＩｕＫａｉ ，ＷＡＮＣｈａｎｇ－ｘｉｕ ，ＺＨＡＯ Ｑｉａｎｇ ，ＣＨＥＮ ，ＬＩ Ｔｉａｎ—ｑｕａｎ （１．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００６５，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｔｈｅ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６ １００６５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＲＧＤ ｉＳ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｗａｙｓ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｔｈｅ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ．ＲＧＤ ｉｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｈｅ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ—ＲＧＤ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ—－ＲＧＤ ｐＯＳＳｅＳＳｅｓ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｔｅ．． ｉｒａｌｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌ１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＲＧＤ；ｌｉｑｕｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ；ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ
