DNA 的定量测定

一 实验目的

学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。

二 实验原理

强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。

H+DNA(脱氧戊糖基）HOCH2COCH2CH2CHO蓝色化合物

DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。

三 试剂和器材 （一）器材 1．粗制DNA。 2．坐标纸。

3．试管 1.5 cm *15 cm （*7）

4．吸管0.20 ml (﹡2) 、0.50ml(*3) 、1.0ml(*2)。 5．722 型（或7220 型）分光光度计。 6．恒温水浴锅。

（一）试剂

1． DNA 标准液（200μg/ml）: 取DNA钠盐 用5 mmol/L的NaOH配成200μg/ml 的溶液。

2． 二苯胺试剂： 称取纯二苯胺（如不纯, 需在70% 乙醇中重结晶2次）1

克溶于100 ml 分析纯的冰醋酸中，再加入10ml 过氯酸（A.R., 60% 以上），混匀待用。当所用药品纯净时，配成试剂应为无色，临用前加入1ml 1.6% 乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用），贮于棕色瓶。

3． DNA样液：将实验所得的DNA粗品用蒸馏水溶解，定溶至50 ml，控

制其DNA含量在100μg/ml左右。

四 操作方法

1．标准曲线的绘制

按表1 加入各种试剂，混匀，于60 ℃ 恒温水浴保温45 min， 冷却后，在595 nm波长下，于722型分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，

制定标准曲线。 2．样品的测定

吸取DNA样液1.0 ml， 加入蒸馏水1.0 ml， 混匀。然后准确加入二苯胺试剂4.0 ml，混匀，于60 ℃ 恒温水浴锅保温45 min，冷却后，选595 nm波长，于722型分光光度计比色测定，根据所测得得吸光度对照标准曲线求得DNA的质量（μg）。

3．计算100 g猪肝中DNA含量：

ω= (m1 / m2) *100%

式中 ω： DNA的质量分数（％）；

m1 样液中测得DNA的质量（μg）； m2 样液中所含样品的质量（μg）。

表 １ 二苯胺法测定DNA含量――标准曲线的绘制 管号 ０ １ ２ ３ ４ ５ 试剂 标准DNA 溶液／0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 ml 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 二苯胺试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 A 595nm

五 思考题

1. 现有三瓶未知溶液，已知它们分别为蛋白质、糖和DNA，采用什么试剂或方法鉴定（请自行设计简便的实验）？

2. DNA含量测定的方法有哪些？各有何优缺点？ 3. 简述二苯胺法测DNA的基本原理。