１３８ 浙江中西医结合杂志２０１０年第２０卷第３期Ｚｈｅｊｉａｎｇ ＪＩＴＣＷＭ（Ｖｏ１．２０ Ｎｏ．３ ２０１０） ・论 著・ 自体与新鲜同种异体骨软骨移植的实验研究 应小樟石仕元胡德新郑 琦魏威杭州市红十字会医院骨科杭州３１０００３ 摘要 目的：评价自体与新鲜异体骨软骨镶嵌移植两种方法修复全层关节软骨缺损的生物学特 性和修复效果。方法：采用完全随机设计，将ｌ６只新西兰大白兔的左右后肢制成全层软骨缺损模 型，分别进行自体骨软骨镶嵌移植、同种异体骨软骨镶嵌移植修复。术后第１２周处死动物取材，分 别进行膝关节活动度测定、大体观察、光镜观察及Ｗａｋｉｔａｎｉ组织学评分法，数据行统计学分析。结 果：膝关节伸屈活动度、大体观察、组织学光镜及组织修复评分显示自体骨软骨移植在第１２周时能 以类透明软骨组织修复缺损，而新鲜同种异体骨软骨移植为纤维肉芽组织。结论：自体骨软骨镶嵌 移植可以修复兔关节软骨的缺损。新鲜无处理的同种异体骨软骨镶嵌移植修复关节软骨缺损不可 行，其排斥反应及吸收破坏严重 关键词 新西兰兔 关节软骨缺损 骨软骨移植 自体骨 同种异体骨 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｎ Ｒｅｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ Ｇｒａｆｔｓ ｏｒ Ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ＹＩＮＧ Ｘｉａｏｚｈａｎｇ，ＳＨＩ Ｓｈｉｙｕａｎ，ＨＵ Ｄｅｘｉｎ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｐａ￣ｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１０００３，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓｔｉｃｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｌａ ｇｒａｆｔｓ ａｎｄ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｉｎ ｗｅｉｇｈｔ—ｂｅａｒｉｎｇ ｊｏｉｎｔｓ，ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｐｒｏｐｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓｉｘｔｅｅｎ ａｄｕｌｔ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ２ ｒｇｏｕｐｓ．Ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ，ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｎｄ ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｒｅｐａｉｉｒｎｇ ｓｉｚｅ—ｍａｔｃｈｅｄ，ｆｕｌｌ— ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｍｏｒａｌ ｃｏｎｄｙｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｋｎｅｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅＦｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｇｒｏｓｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｔ １２ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ． Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｓｔｅｏｅｈｏｎｄｒｌａ ｇｒａｆｔｓ ｒｅｐａｉｒｅｄ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｙａｌｉｎｅ—ｌｉｋｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｔ １２ ｗｅｅｋｓ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｏｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｗｅｒｅ ｆｉｌｌｅｄ ｗｉｔｈ ｆｉｂｒｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｇｒａｆｔｓ ｃａｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｌｕｌｙ ｒｅｐａｉｒ ｔｈｅ ａｔｒｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ．Ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｒｅｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ ａｒｅ ｎｏｔ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｉｔｓ ｓｅｖｅｒｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ａｕｔｏｇｒａｆｔｓ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ 关节软骨是一种无血管、神经和淋巴管的组织， １材料与方法 缺乏基质干细胞，其自我修复能力极其有限。近几 １．１ 实验动物 采用健康成年纯种新西兰大白兔 年国内已先后开展自体骨软骨镶嵌移植，并有良好 ｌ６只，雌雄不限，体质量３．０—４．５ ｋｇ，由浙江中医 的临床报道 １卫Ｊ。但该方法的软骨供区十分缺乏， 药大学提供，饲养环境温度ｌ８—２２℃。实验动物分 制约了该技术的广泛应用。如何克服这种供区不足 为两组（自体软骨移植、含富集骨髓干细胞松质骨 的困难，依然是关节外科医生的挑战。本实验采用 移植），每组８只ｌ６膝。两组动物均不运动。 含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植修复兔关节软骨 手术前观察所有动物无跛行，双膝关节活动正常。 缺损，并与自体骨软骨移植进行比较研究。通过大 １．２ 方 法 体、光镜观察及Ｗａｋｉｔａｎｉ组织学评分，探讨新鲜同种 １．２．１ 制备软骨缺损模型 将兔用３％戊巴比妥 异体骨软骨移植修复关节软骨缺损的可行性，为临 钠，以１ｍｌ／ｋｇ体重兔耳缘静脉注射麻醉。兔双侧膝 床应用提供参考。 关节前内侧纵行切口，保持髌韧带完整性，将髌骨翻 基金项臼：杭州市科技发展汁划重点专科专病专项（Ｎｏ．２０ｏ７０４３３Ｑ２０） 通讯作者：石仕元，男，主仟中医师，Ｔｅｌ：０５７ｌ・５６１０９７５６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｓｙｌｆ＠ ｈｚ．ｚｊ．Ｃｌｌ 浙江中西医结合杂志２０１０年第２Ｏ卷第３期Ｚｈｅｊｉａｎｇ ＪＩＴＣＷＭ（Ｖｏ１．２０ Ｎｏ．３ ２０１０） １３９ 向外侧，显露股骨髁，在股骨髁中部髌股关节处用利 刀制造相应大小的全层关节软骨缺损，深达软骨下 骨质，平均深度约５．Ｏｍｍ。 １．２．２ 自体骨软骨移植 自体移植组用特制取骨 器在股骨外髁非负重区取相应大小骨软骨柱，直径 约４．Ｏｍｍ，长度约５．Ｏｍｍ，分别镶嵌移植于缺损钻 孑Ｌ处，与所钻孔径及深度相匹配，保证牢固嵌合，并 着重注意保持移植后关节面平整，无明显凹凸。缝 合关节囊及滑膜，关闭切口。 １．２．３ 同种异体骨软骨移植 异体移植组随机将 该组动物骨软骨柱对换移植，具体手术方法同自体 移植组。 １．２．４术后处理两组动物术后均肌注青霉素１６ 万单位，ｌ天１次，共用药１周，预防感染。未用免 疫抑制剂，饮食条件相同。不运动，于术后第２ 周开始自由活动，于开阔环境中饲养，人为促进运动 每天半小时。 １．２．５观察方法 各组动物于术后ｌ２周处死，取 股骨髁关节面骨软骨移植处为标本。①大体观察： 实验动物跛行程度和恢复情况，关节活动度（固定 髋关节，距膝关节远侧相等距离悬挂同等重量砝码， 测量膝关节活动度），关节内有无粘连，修复组织表 面的平整光滑程度、有无凹陷，颜色、质地、移植物充 填程度、与周围健康软骨组织连接情况，软骨退变情 况，髌骨沟轮廓恢复情况。②组织学光镜检查：用 ０．１％的甲醛溶液固定缺损修复区及部分周边正常 软骨，将标本以甲酸乙醇液脱钙１周，分别做苏木 精一伊红染色和Ｍａｓｓｏｎ染色切片，观察优势新生组 织的性质、表面特性、与正常软骨连接等组织学特性 等。组织学评分：将标本蜡块包埋、切片，行ＨＥ染 色和甲苯胺蓝染色，按照Ｗａｋｉｔａｎｉ法评分标准的组 织学结果评分表进行评分。 １．２．６统计学方法应用ＳＰＳＳ １３．０统计软件包 处理，采用完全随机设计的单因素方差分析。 ２ 结 果 ２．１活体观察术后１周，全部动物活动减少，跋 行，双膝略肿胀；１周后渐轻，稍有跋行。以后１１周 中采用改良的Ｃｌａｋｅ ｗｅｅｋｎｅｓｓｅｒ检查标准（固定髓关 节，距膝关节远侧相等距离悬挂同等重量砝码，测量 膝关节活动度）测量动物关节伸屈活动范围，可见 术后ｌ２周，自体骨软骨移植组膝关节活动度均优于 同种异体移植骨软骨组（Ｐ＜０．Ｏ１），见表１。 ２．２标本大体观察①自体骨软骨移植组：关节腔 无粘连，无积液，关节液淡黄色，关节内无退变增生。 表１ 两组膝关节伸屈活动范围比较（ ± ） 度 关节面颜色呈乳白色，和周围软骨面无明显差异，表 面光滑平整，与周围正常软骨融合良好。②异体骨 软骨移植组：关节囊有少许挛缩，质硬，关节内纤维 束带与关节表面充填组织有少许粘连，移植骨软骨 柱与受区融合，界限模糊。移植的软骨面萎缩变薄， 少数有软骨面破损，关节面不平，色灰暗，标本软骨 面整个被包裹在纤维组织与炎性组织中，股骨的髌 骨关节沟轮廓不清，退变增生严重。 ２．３组织学光镜观察①自体移植组：骨组织与受 区骨性愈合，关节软骨的厚度与受区正常软骨基本 一致，软骨为透明软骨特性，透明软骨细胞排列规 律，可见软骨陷窝，潮线清楚，表面平整无退变。② 同种异体骨软骨移植组：移植物软骨下板层、骨髓松 质骨与宿主基本连接愈合，但松质骨小梁周围尚未 完全骨化。新生的关节软骨细胞幼稚占多数。交界 处淋巴细胞、浆细胞和多核白细胞浸润减少。无移 植的其他缺损区无软骨形成。 ２．４组织学评分 按照Ｗａｋｉｔａｎｉ法评分标准的组 织学结果评分表进行评分，设５项观察指标：细胞形 态学、基质染色（异染性）、表面规则性、软骨厚度、 与周围软骨整合度。其中，细胞形态学评分为：透明 软骨０、透明软骨为主１、纤维软骨为主２、少量软骨 ３、无软骨４；基质染色（异染性）评分为：正常０，轻 度减少１，明显减少２，无异染性颜色３；表面规则性 评分为：光滑０，中等ｌ，不规则２，极度不规则３；软 骨厚度评分为：＞２／３为０，１／３—２／３为１，＜Ｉ／３为 ２；周围软骨整合度评分为：边缘完全整合为０，一侧 边缘整合为１，未整合为２。 术后１２周，按照Ｗａｋｉｔａｎｉ法评分标准自体骨软 骨移植较新鲜异体骨软骨移植在细胞形态、基质染 色、表面平整、软骨厚度、周围接合及总分方面，差异 有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。见表２。 ３讨论 关节软骨损伤后自身修复能力十分有限，较大 面积的缺损无法自行修复。临床上应用的方法主要 有：①微骨折技术：通过穿透软骨下骨板，使包含骨 髓多能间充质干细胞的血凝块聚集在软骨缺损区的 浙江中西医结合杂志２０１０年第２Ｏ卷第３期表２两组移植面组织学评分比较（冤±ｓ） Ｚｈ￣ｉａｎｇ ＪＩＴＣＷＭ（Ｖｏ１．２０ Ｎｏ．３ ２０１０ 表面，形成含有Ⅱ型胶原的纤维软骨覆盖缺损区。 骨基质明胶为载体，采用骨髓间充质干细胞或软骨 细胞修复兔软骨损伤方面已取得一定的成果【６ 】。 该技术操作简单易行、成本低下，常被用作首选的治 疗方案。综合各方面的文献资料【３ Ｊ，该方法适用 于软骨缺损面积小于ｌｃｍ 的患者。②骨软骨的嵌 镶移植术：自体骨软骨移植的方法是通过关节边缘 非负重区作为供区，选择软骨厚度适宜的部位，获取 一定数量、大小及长度的骨软骨柱作为移植物，待处 理好受区后予以植人，不需固定。该方法完好地保 持了关节软骨和骨床的紧密连接，具有取材方便，植 人稳定，愈合成活率高及关节软骨修复能力强等优 点，而且可以在关节镜下完成手术。近几年在国内 已先后开展该手术，临床报道效果良好。而同种异 体骨软骨嵌镶移植的效果却报道不一，未在临床上 开展。 目前的实验研究主要集中在两个方面：①组织 移植：主要有自体或异体的骨软骨、软骨、骨膜等。 ②细胞移植：主要有自体或异体富集骨髓干细胞松 质骨的脑胎软骨细胞、软骨膜细胞、骨髓干细胞、转 基因细胞及与载体一起在体外培养构建的工程软 骨等。 组织工程化关节软骨的研究近几年不断增加， 研究主要集中在软骨组织工程载体、种子细胞和生 物因子等方面。载体材料包括天然和人工合成 可降解的复合物。天然材料主要有胶原、明胶、纤维 蛋白和藻酸盐等，存在的问题主要是力学性能差，极 易为活性酶降解，吸收过快。人工合成高分子聚合 物具有良好的生物相容性，常用的有聚酸乳、聚羟基 乙酸及其共聚物。种子细胞目前常用的有软骨细 胞、骨髓基质干细胞（ＢＭＳＣｓ）和胚胎干细胞（ＥＳｓ）。 生物因子繁多，其中以骨形态发生蛋白（ＢＭＰ） 的研究最多，现在采用基因重组技术已成功分离和 克隆出近４Ｏ种ＢＭＰ，在体外诱导软骨表型分化方 面发挥了显著的作用。国内学者以藻酸盐、聚乳酸、 总体分析，该类方法操作复杂，用于临床尚早。 本实验探讨同种异体骨软骨用于修复负重区软 骨缺损的可行性。通过采用多种观察指标比较了自 体和同种异体骨软骨移植两种方法修复关节软骨缺 损的效果。实验结果显示，新鲜无处理的同种异体 骨软骨镶嵌移植修复关节软骨缺损不可行，其排斥 反应及吸收破坏严重，疗效不确切，不建议使用。 参考文献 ［１］ 董启榕，郑祖．自体嵌镶式骨软骨移植修复膝关节软 骨缺损［Ｊ］．中华创伤杂志，２００３，１９：４６１－４６２． ［２］ 张维春，高石军，陈百成等．关节镜下自体骨软骨移植 修复股骨关节面软骨缺损［Ｊ］．中华骨科杂志，２００４， ２４：１５８－１６１． ［３］Ｆｒｉｓｂｉｅ ＤＤ，Ｏｘｆｏｒｄ ＪＴ，Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｅａｄｙ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｒｅｐａｉｒ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｈｏｎｄｒＭ ｂｏｎｅ ｍｉｃｒｏｆｒａｅｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｏｎｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｄ，２００３，４０７：２１５－２２７． ［４］ Ｓｌｅｄｇｅ ＳＬ．Ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｉｎｊｕｒｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ ｓｐｏｔｓ Ｍｅｄ，２００１，２０： ３６５．３７７． ［５］Ｇｏｂｂｉ Ａ，Ｎｕｎａｇ Ｐ，Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｋ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋ． ｎｅｓｓ ｃｈｏｎｄｒａｌ ｌｅｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｎｅｅ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ ｉｎ ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ａｔｈｌｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｋｎｅｅ Ｓｕｒｇ Ｓｐｏｔｓ Ｔｒａｕｍａｔｏｒ Ａｒｔｈｒｏ－ ＳＣ，２００５，１３：２１３－２２１． ［６］ 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