实验二过氧化氢酶Km值的测定

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第 2 次课

授课时间： 2006 年 11 月 5 日～ 11 月 9 日

课程名称 生物化学与分子生物学实验课 年级 2006 专业、层次 授课教师 许成山 职称 助教 课 型 (大、小 ) 小 授课题目〔章、节〕 实验二 过氧化氢酶 Km 值的测定 根本教材或主要参考书 教学目的与要求：

自编生物化学与分子生物学实验指导

临床医学本科

学时 3

1、稳固酶促反响有关参数的知识，加深理解

Km 值的定义；

2、学习 Hanes 作图法测定 Km 值的原理和方法； 3、掌握滴定管的使用和滴定终点的判断。

大体内容与时间安排，教学方法：

1、Km 值的定义及求 Km 值的作图方法〔林 -贝氏作图法和 Hanes作图法〕

5min 5min 10min 100min

2、过氧化氢酶 Km 值测定的原理

3、过氧化氢酶 Km 值测定的考前须知

4、学生做实验

教学方法：实验 +示教

教学重点、难点：

重点： 1、Hanes作图法求 Km 值

2、过氧化氢酶 Km 值测定的原理

3、滴定管的使用和滴定终点的判断

难点：过氧化氢酶 Km 值测定的原理 教研室审阅意见：

教研室主任签名：

年 月 日

1

实验二过氧化氢酶Km值的测定

根本内容

手段 提问

课堂设计和时间分配

1min

一、 Km 值的定义：

当酶促反响速度等于最大反响速度一半时的底物浓度即为 Km 值； Km 值是酶促反响的特征性常数。

二、 Km 值的作图方法 〔一〕双倒数作图法

〔林－贝氏作图法〕 〔二〕 Hanes作图法

简图

4min

以 1/[S]为横坐标，以 1/V 为纵坐标求 Km 值。

简图

[S]/V 为横坐标，以 [S] 为纵坐标求 Km 值。

三、过氧化氢酶 Km 值

测定的原理

示范操 作

四、实验操作

在实验 过程中 进行巡

五、考前须知

视，注意

5min

1、 H2O2 在过氧化氢酶的作用下分解生成了 H2O 和 O2； 2、 [S]=参加的 H2O2 的量； 3、V=固定时间内反响掉的 H2O2 的量 =参加 H2O2 的量－

剩余 H2O2 的量；

4、剩余 H2O2 的量可通过 KMnO 4 滴定测出：

2KMnO 4+5H2O2 +3H2SO4→ 2MnSO4+K 2SO4+5O2+8H2O

1、只做第 3 步；

2、表格下：将各瓶置于 37℃水浴预热 5min 改为室温摇匀。

纠正学 生的不 标准操 作

10min

1、参加 1:1000 稀释血清瓶后保温准 5 分钟； 2、硫酸的浓度较大，小心不要溅出 !!! 3、作图应该用坐标纸，标明有关参数 4、滴定操作：

〔1〕使用滴定管前要先检查滴定管是否漏水或有堵塞；〔2〕滴定管使用前还要润洗〔加 KMnO 4 至刻度线 24ml

处；

〔3〕使用时，不能左右推动活塞〔要以环指顶住管壁，

拇指、食指和中指控制流量；

〔4〕加滴定液时，液面要稍高于 0，此后排除尖端气体；〔5〕读数时，视线要与液面凹陷最低点平行。

六、实验结果

列表计算出有关数据，在坐标纸上作图求出

100min

Km 值。

七、学生做实验

2

实验二过氧化氢酶Km值的测定

Km 值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反响条件

(如

温度、 pH、有无抑制剂等 )有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同， Km 值不同，同一种酶与不同底物作用时， Km 值也不同。 Km 值愈大，酶与底物的亲和力愈小； Km 值愈小，酶与底物亲和力愈大。

小 结

复习思

某种酶的 Km 值为，试问要使此酶所催化的反响速度到达最大反 应速度的 80%时底物浓度应是多少？

考题、 作业题

下次课 预 习 要

质粒转化的相关概念。

参考内容 :?生物化学与分子生物学实验技术? 或?分子生物学实验技术?中“

DNA 重组技术〞相关内容。

点

实 施 情况及 分 析

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