基于纳米酶的纳米等离子体催化传感研究

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摘要

二十世纪九十年代始，随着纳米结构、纳米技术和纳米粒子的研究，纳米等离子体开始广泛应用于传感器领域。纳米等离子体传感器就是利用纳米等离子体的LSPR，增强传感器信号，将生物化学信号转换为电信号的一类传感器。由于具有灵敏度高、无需标记、实时在线检测、抗干扰能力强和无损伤检验等特点，广泛应用于生物、化学、医药、食品和环境等领域。

纳米酶是基于直径小于100纳米的纳米材料所具有的催化功能或者存在于周围单层上的官能团的一种模拟自然系统中生物酶的人造酶，。具有催化效率高、稳定、经济和规模化制备的特点，所以在医药、食品、化工、农业和环境等领域得到广泛的应用。

首先，结合金纳米粒子的局域表面等离子体共振（LSPR）现象和模拟葡萄糖氧化酶活性两大特点，构建纳米等离子体传感器。对纳米等离子体传感体系中AuNPs的尺寸、浓度进行探究，并对传感测试条件温度、pH进行优化。将优化后的传感器用于葡萄糖的检测，并进行选择性和干扰测试。在干扰测试中选择的是尿酸和尿素，试验结果表明所构建的纳米等离子体传感器具有很好的选择性，对尿素也有抗干扰能力，而尿酸对传感器的干扰较大。传感器虽然具有较高的灵敏度和较低的检测限但是传感器使用的是分散体系的纳米酶，具有稳定性不好、高消耗等问题。

其次，针对尿酸对纳米等离子体传感器具有很强的干扰的情况，我们发现借助这一特性，可以利用葡萄糖纳米等离子体传感来检测尿酸。用比色法试验对尿酸的干扰情况进一步确认，对尿酸进行检测，并对检测尿酸的比色法和纳米等离子体传感方法进行比较。这一检测方法还有待进一步完善和深入。

最后，针对纳米等离子体传感器的稳定性和高消耗等问题，进一步优化改进。主要工作包括AuNPs@SiO2复合纳米材料的制备及表征，传感测试条件pH和温度的优化，并用于葡萄糖的检测等。试验成功解决了分散系不稳定不好和高消耗等问题，同时还能保证在小尺寸纳米金（3nm）在微型光谱仪中的完整共振吸收峰，并且在高温处理过程中并没有发生大量聚集。

关键词：LSPR，AuNPs，葡萄糖，纳米等离子体传感器，尿酸

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ABSTRACT

Since the 1990s, with the development of nanostructures, nanotechnology and nanoparticle, nanoplasma has been widely used in the field of sensors. Nanoplasmonic sensors use localized surface nanoplasma resonance to enhance sensor signals and convert biochemical signals into electrical signals. Because of its high sensitivity, no marking, real-time on-line detection, strong anti-interference ability and no damage inspection, it is widely used in biology, chemistry, medicine, food, and environment.

Nanozymes are man-made enzymes that mimic biological enzymes in the natural system, based on the catalytic function possessed by nanomaterials with a diameter of less than 100 nm or functional groups present on the surrounding monolayers. With the characteristics of high catalytic efficiency, stability, economy, and large-scale preparation, it has been widely used in the fields of medicine, food, chemical engineering, agriculture, and the environment.

First, a nanoplasma sensor was constructed in combination with the localized surface plasmon resonance (LSPR) phenomenon of gold nanoparticles and simulated glucose oxidase activity. The size and concentration of AuNPs in the nano-plasma sensing system were investigated, and the temperature and pH of the sensing conditions were optimized. The optimized sensor is used for the detection of glucose, and selective and interference tests are performed. The uric acid and urea were selected in the interference test. The experimental results showed that the nano-plasma sensor has good selectivity and anti-interference ability to urea, while uric acid interferes with the sensor. The sensor has the advantages of higher sensitivity and lower detection limit. Due to the use of dispersed nanozymes, the stability is poor and the consumption is high.

Secondly, we have found that uric acid can be used to detect uric acid using glucose nanoplasma sensing because of its strong interference with nanoplasma sensors. The colorimetric test was used to further confirm the interference with uric acid, and the uric acid was detected. The colorimetric method for detecting uric acid was compared with the nanoplasma sensing method. This detection method needs to be further improved and in-depth.

Finally, for the stability and high consumption of nano-plasma sensors, the optimization and improvement are further improved. The main tasks include the preparation and characterization of AuNPs@SiO2 composite nanomaterials, the

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optimization of pH and temperature for sensing conditions, and the detection of glucose. The test successfully solved the problem of unstable instability and high consumption of the dispersion, and at the same time ensured the complete resonance absorption peak of the small-sized nano-gold (3 nm) in the micro-spectrometer and did not generate a large amount of aggregation during the high-temperature treatment.

Keywords:LSPR, AuNPs, glucose ,Nanometer plasma sensor,

III

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中文摘要 .......................................................................................................................................... I 英文摘要 ........................................................................................................................................ II 1 绪论 ......................................................................................................................................... 1

1.1引言 ............................................................................................................................................ 1 1.2纳米酶 ........................................................................................................................................ 1 1.3纳米等离子体传感器 ................................................................................................................ 7 1.3.1局域表面等离子体共振 ..................................................................................................... 7 1.3.2纳米等离子体传感器概述 ................................................................................................. 9 1.3.3纳米等离子体传感器研究进展 ....................................................................................... 11 1.4本课题的研究目的、内容及创新点 ...................................................................................... 15 1.4.1研究目的 ........................................................................................................................... 15 1.4.2研究内容 ........................................................................................................................... 15 1.4.3创新点 ............................................................................................................................... 16

2 基于金纳米等离子体催化传感葡萄糖的检测 ................................................. 17

2.1引言 .......................................................................................................................................... 17 2.2实验内容 .................................................................................................................................. 17 2.2.1实验药品与仪器 ............................................................................................................... 17 2.2.2金纳米等离子体的制备 ................................................................................................... 18 2.2.3金纳米等离子体的类葡萄糖氧化酶活性及传感条件的优化 ........................................ 19 2.2.4金纳米等离子体催化传感葡萄糖 ................................................................................... 21 2.2.5模拟样品检验 ................................................................................................................... 22 2.3结果与讨论 .............................................................................................................................. 22 2.3.1AuNPs的表征 .................................................................................................................... 22 2.3.2金纳米等离子催化传感条件的影响 ............................................................................... 24 2.3.3金纳米等离子体催化传感葡萄糖 ................................................................................... 27 2.3.4传感器的准确度和精密度 ............................................................................................... 29 2.4结语 .......................................................................................................................................... 30

3 基于金纳米等离子体催化传感尿酸的检测 ....................................................... 31

3.1引言 .......................................................................................................................................... 31 3.2实验部分 .................................................................................................................................. 31 3.2.1实验药品与仪器 ............................................................................................................... 31

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3.2.2金纳米等离子体催化传感尿酸的响应 ........................................................................... 31 3.2.3葡萄糖浓度的影响 ........................................................................................................... 32 3.2.4尿酸检测 ........................................................................................................................... 32 3.2.4模拟样品检测 ................................................................................................................... 32 3.3结果与讨论 .............................................................................................................................. 32 3.3.1检测方法的原理 ............................................................................................................... 32 3.3.2葡萄糖浓度的影响 ........................................................................................................... 33 3.3.3尿酸的监测 ....................................................................................................................... 35 3.3.4准确度与精密度 ............................................................................................................... 36 3.4结语 .......................................................................................................................................... 37

4 AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜催化传感葡萄糖的检测 ........................ 39

4.1引言 .......................................................................................................................................... 39 4.2实验内容 .................................................................................................................................. 39 4.2.1实验药品与仪器 ............................................................................................................... 39 4.2.2金纳米等离子备 ....................................................................................................... 39 4.2.3AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜制备 ............................................................................. 40 4.2.4Au@SiO2纳米等离子体薄膜的葡萄糖催化活性实验 .................................................... 41 4.2.5葡萄糖催化氧化的等离子体响应及条件优化实验 ....................................................... 41 4.2.6AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜检测葡萄糖 ................................................................. 41 4.2.7模拟样品检测 ................................................................................................................... 42 4.3结果与讨论 .............................................................................................................................. 42 4.3.1退火温度和时间的影响 ................................................................................................... 42 4.3.2AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜的表征 ......................................................................... 43 4.3.3 AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜的葡萄糖氧化酶活性 ................................................ 45 4.3.4葡萄糖催化氧化等离子体响应 ....................................................................................... 46 4.3.5基于纳米等离子催化传感的葡萄糖浓度监测 ............................................................... 47 4.3.6准确度与精密度 ............................................................................................................... 48 4.4结语 .......................................................................................................................................... 48

5 总结与展望 ............................................................................................................................ 49

5.1总结 .......................................................................................................................................... 49 5.2展望 .......................................................................................................................................... 49

致谢 ....................................................................................................................................... 50 参考文献 ....................................................................................................................................... 51 附录 ....................................................................................................................................... 57

A．作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录 ......................................................................... 57

重庆大学硕士学位论文 1 绪论

1 绪论

1.1引言

葡萄糖（Glucose）的化学式为C6H12O6，它是自然界分布最广也最重要的一种单糖，他是一种多羟基醛。葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，也是合成很多工业产品的原料和中间体。在糖果制造业和医药领域都有着广泛的应用。固葡萄糖浓度的检测在健康监控、环境富氧化控制以及工业生产等领域具有重要的实际意义。特别是随着经济社会的发展，物质生活的极大丰富，人们对心理和生理健康越来越重视，在威胁人类健康的多种疾病中，常见的就有糖尿病，以至于出现“谈糖色变”的现象。对葡萄糖浓度实时、快速、便捷监控提出了要求。因此也成为研究的热门课题。

葡萄糖浓度检测方法主要有HPLC法、分光光度法、旋光度法、气相色谱法和生物传感器法。这些方法各有利弊，高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法发展非常快，它的优点之一就是不需要预先衍生就能分析几乎所有的单糖和大部分寡糖和低聚糖，节约了时间和金钱避免有毒衍生试剂的使用，减少环境污染。分光光度法需要加入显色剂污染环境也提高了检测成本。而旋光光度法只适用于做一种辅助手段。气相色谱法需要将葡萄糖硅醚化处理操作较为复杂。相较之下，生物传感器法具有线性检测范围宽、灵敏度高等优点，且成本还低，实时方便等特点具有较好的应用前景。

纳米等离子体传感器作为重要的生物传感器，与生物传感器一样，主要由分子识别部分（敏感元件）和转换部分（换能器）构成。纳米等离子体传感器是基于金属纳米粒子的局域表面等离子体共振效应（LSPR），具有实时、高效、高灵敏度等特点。而且表面等离子体效应（SPR）是于金属表面或金属周围产生，可使纳米结构形式的金属电磁场高度局域化，从而产生局域表面等离子体共振特性。局域表面等离子体效应传感器（简称等离子体传感器）与其他传感器相比，光学设备更加简单，成本也更低。本章节随后，主要介绍具有类葡萄糖氧化酶的人工酶（纳米酶），其次是对纳米等离子体传感器的概述以及LSPR概念，还有纳米等离子体传感器的传感原理和研究进展等。最后对本论文的研究目的、内容和创新点进行的阐述。

1.2纳米酶

纳米酶是一种模拟自然系统中生物酶的人造酶，它是基于直径在小于100纳米的纳米材料本身所具有的催化功能或者存在于周围单层上的官能团。纳米酶具

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有催化效率高、稳定、经济和规模化制备的特点。它在医药、食品、化工、农业和环境等领域得到广泛的应用。典型的纳米酶有AuNPs[1][2][3][4][5][6][7][8][9]、PtNPs、双金属纳米粒子、二氧化铈纳米粒子、五氧化二钒纳米粒子、碳纳米管、氧化石墨烯、纳米金属有机框架等。根据结构特点，可以将这些纳米酶粗略分为四大类：金属类纳米材料、金属氧化物类纳米材料、碳类纳米材料、其它纳米材料见表1。

表1.1 典型纳米酶及其对应的酶活性

Table11.1 Typical nanozymes and their corresponding activities 纳米酶种类金属类纳米材料

实例金纳米材料

酶活性核酸酶、酯酶、硅蛋白、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化

酶

铂纳米粒子

过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化

酶

双金属纳米粒子

金属氧化物类纳米材

料

二氧化铈纳米粒子

过氧化物酶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、氧化酶、磷酸酶和过氧化物酶

磁性纳米粒子

过氧化物酶、过氧化

氢酶

五氧化二钒纳米粒子

碳类纳米材料

富勒烯及其衍生物氧化石墨烯碳纳米管碳纳米点

其它纳米材料

金属有机框架 CdS–Pt纳米粒子 PtPd−Fe3O 4

过氧化物酶超氧化物歧化酶过氧化物酶过氧化物酶过氧化物酶过氧化物酶还原酶过氧化物酶

特别近年一些研究报告[10]中，纳米金是一个天才因具有各种酶活性被广泛关注，包括模仿核酸酶、酯酶、蛋白、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等。

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①拟葡萄糖氧化酶

葡萄糖氧化酶是一种氧化还原酶在氧气存在下，可以用来催化氧化-D-葡萄糖生成葡萄糖酸，氧气作为电子受体，同时生成过氧化氢。由于它具在生物传感、化学、药物、食品、临床化学、生物技术以及其他行业具有很广的应用吸引了大量学者的兴趣。Rossi[11]等人首先发现裸金纳米粒子的模拟葡萄糖氧化酶活性即使纳米金催化氧气氧化葡萄糖并生成葡萄糖酸和双氧水，如图1.1（a）[11]所示，与此相反的是其他金属纳米材料如铜、银、钯和铂在类似的催化氧化条件下，并没有表现出类似的氧化酶活性。由于在金的表面和其他物质具有很弱的结合，使得金表面具有更多的活性位点。纳米金这种特有的氧化催化葡萄糖的反应活性与最近在金表面的氧的研究模型相一致：和其他金属相比，氧原子与纳米金表面具有较弱的相互作用。纳米金这种模拟葡萄糖氧化酶活性的行为，可以作为葡萄糖氧化酶的替代人工酶。同时，也有学者[12]观察到在金纳米粒子小于6nm时，在相同的金纳米粒子浓度时，催化活性与纳米金直径成反比，但纳米金粒子的稳定性和活性，不会有直接联系，如碳载金粒子就能长期保存稳定和活性。结合碱的促进作用，分子活化机理如图1.1（b）[13]，首先富含电子的金首先由水合葡萄糖阴离子与金原子表面的相互作用（亲核反应）形成，然后，不稳定中间价态的金分解成Au+O2-或者Au2+ O22-，这个过程可以被看作是两种电子从葡萄糖转移到氧的两种方式。在这些研究的基础上，Fan等人报道了一个有趣的自催化自性系统，可以控制模拟葡萄糖氧化酶的纳米金粒子的生长。如图1.1（C），在这个系统里，AuNPs既作为种子又作为催化剂，即是纳米金粒子催化氧化葡萄糖并原位产生过氧化氢，导致在氯金酸离子存在下纳米金粒子作为种子并生长。更重要的是，AuNPs的生长是内部两个因素的反馈，纳米金表面钝化和依赖纳米金尺寸的葡萄糖氧化酶活性，导致自我系统。为新型纳米材料的控制合成、智能自限给药系统的设计以及深入理解自限性系统提供了一种新的方法。

纳米金的模拟葡萄糖氧化酶在许多方面都有广泛的应用，如人造串联反应，Tang等人就设计了一款人工智能结构（Fe3O4-Au@mesoporous SiO2 microspheres）

[14]

作为人工酶串联系统实现模拟双酶，通过人工酶串联系统的颜色反应，作者希

望它们可以用于靶向肿瘤组织细胞的可视化探针，检测生物分子和催化生化反应。又比如生物分析方面，Fan等人[15]介绍了用基于具有葡萄糖氧化酶活性的纳米金作为一个简单可靠的DNA、RNA核酸以及葡萄糖检测平台。由于还有很多内容有待介绍，这部分将不再进行赘述。

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图1.1（a）不同金属粒子的类葡萄糖氧化酶催化活性。（b）葡萄糖氧化的大致机理。（c）基于

纳米金粒子的自我生长系统示意图。

Fig1.1.(a) The GOx-like catalytic activity of different metal particles. (b) The proposed mechanism for glucose oxidation. (c) Schematic demonstration of the AuNPs-based self-limiting growth system.

②拟过氧化物酶

在酶类中过氧化氢酶是一个大家族，典型的过氧化物酶是催化相应的过氧化物基底（在大多例子中，指H2O2）。目前过氧化物酶已经广泛用于生物分析和临床化学上，特别是过氧辣根酶。2008年，Yan[16]等人报道了通常被认为在化学和生物学上惰性的磁性纳米粒子具有让人兴奋的过氧化物酶活性。因为这篇首创性文献，许多研究者开始运用磁性纳米粒子致力于设计和发展具有拟过氧化物酶的多功能纳米材料。其中，不同类型（如图1.2所示）基于金催化也被报道具有固有的拟过氧化物酶活性，很多已经用于生化分析。例如，Li[17]和Wang[18]等人发现半胱胺修饰的AuNPs和牛血清蛋白修饰的金团簇（AuNCs ）具有固有的拟过氧化物酶活性。其中，Li等人进一步对拟过氧化物酶的催化过程的机理做了可能的设想，认为，首先过氧化氢会被吸附到金纳米材料的表面，然后H2O2的O-O健被分解为两个羟基自由基，同时生成的羟基自由基被金纳米材料通过电子的交换相互作用给稳定，这一过程就决定了金纳米材料的催化能力。另外，Xie等人[19]也证明裸金在石墨烯的表面直接或者间接生长得到石墨烯-金纳米粒子的复合材料，这种材料在拟过氧化酶反应中表现出令人印象深刻的催化性能，更重要的是，这种混合催化剂展现出令人意外的高活性，在相同条件下，比未负载的AuNPs和石墨烯单独高9到15倍[20]，表明复合物中两种活性较低的组分对拟过氧化物酶具有正协同作用。在单壁碳纳米管上原位生长带正电荷的金纳米粒子也观察到类似的协同效应。

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图1.2设计基于金的纳米材料的拟过氧化物酶

Fig1.2.Gold-based nanomaterials for the design of peroxidase mimics.

③拟超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）对几乎所有暴露于氧气的细胞的抗氧化剂防御都很重要。它能催化歧化超氧化物成O2和H2O2。而且过氧化氢酶是保护细胞免受活性氧的氧化损伤的重要酶。它催化过氧化氢分解成H2O和O2。这两种酶显示出互补的功能，由SOD产生的有毒中间体H2O2可被过氧化氢酶迅速消除。因此SOD和过氧化氢酶的联合作用早已被证明能有效地清除超氧化物。此前，已发现纳米CeO2具有超氧化物COD模拟活性和过氧化氢酶模拟活性[21][22]，并已在几种细胞培养物和动物模型系统中显示对活性氧的保护作用。Yin等人[23]也证明了AuNPs使用电子自旋共振光谱与自旋捕获和自旋标记相结合，如图1.3所示，显示内在的SOD样和拟过氧化氢酶活性。作者发现pH值在确定它们的催化活性方面起着至关重要的作用。在生理pH条件下，AuNPs表现出内在的SOD样活性，因为它们可以有效地催化超氧化物的歧化。在碱性条件下，纳米金表现出内在的类过氧化氢酶的催化活性，因为AuNPs可以将H2O2转化为H2O和O2。相反，没有碱性条件，铂纳米颗粒显示高于过氧化氢酶活性。在酸性pH下，金纳米粒子的SOD和拟过氧化氢酶活性显著降低。更糟糕的是，纳米金导致H2O2存在下，在酸性微环境中产生羟基自由基，这可能促进氧化细胞内和细胞外组分诱导细胞凋亡。当然除了pH的影响之外，纳米金的这些催化活性还强烈依赖于金纳米粒子的尺寸和表面状态。

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图1.3在不同pH值时AuNPs表现出不同的酶活性

Fig1.3. The different enzymatic activities of AuNPs at different pH values

裸纳米金做人工酶有制备方便，且成本低的特点但裸金不稳定容易聚集等缺点。很多学者在纳米金粒子外面修饰上官能团，组成单层保护层的复合结构的纳米材料，依然具有模拟人工酶的性能。具体如下：

④拟核酸酶

由核酸酶（如性核酸酶和非特异性核酸酶）催化的磷酸酯切割，在从生物技术到药理学，以及涉及复制、重组、DNA修复、分子克隆、基因分型和制图的生物过程等各种领域中都是至关重要的。这些核酸酶至少需要一个存在于活性部位的金属离子（如Zn2+，Mg2+和Ca2+），它们不仅激活弱磷酸集团进行亲核反应，但也有利于配位水分子或醇羟基去质子化以提供活性亲核试剂。通常，这些金属离子以协同方式工作，因此，这些磷酸二酯键和催化水解对于两个或更多个金属中心之间的协同性的存在是极好的测试。

⑤拟酯酶

酯酶是一种有水时，将酯水解成一种酯和一种醇的水解酶。最初是在AuNPs表面修饰上咪唑（AuMPC3）实现了羧酸酯的水解，如图1.4（a）。咪唑在很多水解系统中作为协同作用的催化剂被认为是它的特殊用途已经被证实了。通过质子NMR研究所确定的，该体系由十二硫醇的混合单层和咪唑封端的硫醇（它们的摩尔比为1：1）组成。选择底物2,4-二硝基乙酸乙酯（DNPA）作为模型酯来研究所研究的催化剂的催化行为。二级速率常数（k 2）与Au对于AuMPC3和单体催化剂的pH依赖性如图1.4（b）所示。这两个体系的催化活性在两条曲线的最大值的pH值（单体催化剂的pH 7.2和Au MPC3的6.1）下进行了比较。在优化的pH条件下，Au MPC 3催化过程为比使用单体催化剂快30倍。此外pH范围5-7中k 2的依赖性（在pKa附近具有小的最大值）支持了纳米簇（一般酸/一般碱或核苷酸）对DNPA裂解中两个甲基咪唑之间的协同性。

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图1.4（a）AuMPC3作为水解酯酶。（b）AuMPC3和单体的二级反应速率与pH的关系 Fig1.4.(a)AuMPC 3used for the hydrolytic cleavage of ester.(b) Second-order rate constants as a

function of pH for AuMPC3 and monomer

⑥拟聚硅氧烷合成酶

硅蛋白是在马西里海绵里二氧化硅针中发现的一种蛋白质，可以浓缩和水解前体正硅酸乙酯分子，在中性环境和环境温度下形成具有可控形状的二氧化硅结构。Morse[24]和其伙伴就成功的合成了两个AuMPCs（AuMPCs7和AuMPCs8），具有聚硅氧烷合成酶的活性。

1.3纳米等离子体传感器

1.3.1局域表面等离子体共振（LSPR）

局域表面等离子体共振[27]（Localized Surface Plasmon Resonance）是指金、银、铂等贵金属纳米粒子的表面有与纳米粒子表面电子的震动频率相匹配的入射光时，金属纳米粒子就会对这种入射光子能量产生很强的吸收作用，引发纳米粒子表面传导电子的集体相干振荡的现象。另一种说法是入射光的电磁场与纳米粒子的自由电子的电磁场相互作用，导致自由电子与金属离子之间的电荷分离同时自由电子之间的库仑排斥力会形成恢复力推动自由电子向反方向移动，于是就导致了电子的集体振荡现象，这种现象就被称为局域表面等离子体共振现象或者叫局域表面等离子体共振激发现象。不同形貌、尺寸和材料的金属纳米粒子对入射光显示出不同的特征吸收特性并因此可以显示出不同的颜色，如图1.6（a）是球形纳米粒子的LSPR激发示意图，从图1.6（b）中可以看到其吸收光谱只有一个明显的吸收带。而对于金纳米棒，如图（a）、（b）所示，其吸收光谱明显有两个吸收带，分别是纵向等离子体激元带（LPB）、横向等离子体激元带（TPB）。因此，LSPR的性质高度依赖金属纳米粒子的尺寸、形貌和介电性质以及局部周围介质的性质，因为这些因素影响颗粒表面的电子电荷密度。LSPR对局部电介质环境中的折射率变化也非常敏感。在许多的传感器方案中，金属纳米粒子的吸收光谱中最大吸收波长或者峰值吸光度的变化被用作LSPR传感器响应的指标[29][30]。本文中就是应

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用峰值波长的变化作为传感器响应的指标。

图1.5不同形貌比的金纳米粒子具有不同特征颜色的实物照片

Fig.1.5.Photograph of AuNPs solutions with different aspect ratios showing the different colors

图1.6（a）金纳米粒子的LSPR激发示意图（b）金纳米粒子典型的LSPR吸收光谱 Fig.1.6. (a) Schematic illustration of LSPR excitation for AuNPs[28]. (b) A typical LSPR absorption

band of AuNPs.

图1.7（a）金纳米棒的LSPR激发示意图。（b）金纳米棒的LSPR吸收带。

Fig.1.7. (a) Schematic illustration of LSPR excitation for GNRs and (b) LSPR absorption bands of GNRs: longitudinal and transverse plasmon bands corresponding to the electron oscillation along the

long axis (Fig. 3(a) top) and the short axis (Fig.3(a) below) of GNR respectively.

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1.3.2纳米等离子体传感器概述

传感器是一种重要的信号检测仪器，在临床诊断、医学发展、非法药物检测、食品质量和安全以及环境监测等许多科学领域中一直发挥重要作用。所谓的传感器是指能感应到被测量并遵循某些规律将其转换成能够输出信号的器件或装置，能将生物、化学方面一些物理量转换为可以储存、处理的物理点信号。传感器根据分类标准不同，可以有很多种分类方法，常分为物理传感器、化学传感器、生物传感器等。生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。是由固定化的生物敏感材料做识别元件，如类酶AuNPs、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质。适当的理化换能器及信号放大装置（如微型光谱仪）的分析工具或系统。利用纳米粒子的局域表面等离子体共振来感应生物化学反应是一种先进的传感技术，因此在许多领域具有潜在的应用价值。从上个世纪九十年代始，纳米等离子体被广泛应用于传感器领域。而第一次公开报道基于局域表面等离子体共振的生物传感器的是Englebienne[31]，他在金纳米粒子表面修饰上抗体（作为识别抗原的识别元件），并且研究了金纳米粒与不同浓度的抗原结合时，AuNPs的共振吸收峰的变化。Haes[32]等人在2004年第一次提出LSPR折射率传感器的无模型化应用。2006年，Sirinakis[33]等人制备了一种金纳米粒子和金属钇稳定的氧化锆（YZS）的复合材料，并将其应用于基于LSPR的高温一氧化碳传感器。2007年，Langhammer[34]等人介绍了一种基于LSPR的氢气传感器。在接下的时间里，金纳米粒子传感器的研究有了进一步的紧张，Novo等人制备了一种金纳米粒子表面，并通过LSPR光谱对在其表面发生的氧化还原反应进行直接观测。目前SPR技术已拥有整套完整的体系及设备。SPR技术传感对金属表面周围的折射率很敏感，因此研究者们根据折射率的变化设计了各种SPR探针，进而检测目标有机物的折射率改变。二十世纪九十年代以来，仪器制造商推出了诸多各式的自动化、商业化的SPR传感器，这对SPR技术的实际应用起了推波助澜的作用。SPR传感器首先在针对生物分子间反应的研究上突显了优势。生物大分子可以被修饰在传感器芯片的表面，这样待测物继而与其特异性结合，SPR光谱就会发生相应的变化。这样就可以实现实时反映反应过程的目的，得到反应物间分子健合的相关信息，从而监测样品中生物分子的浓度。此项技术具有实时监测、无需标记、所需样品少、方便快捷、高灵敏度、无背景干扰、响应速度快等优点[34]。目前在化工、医疗、材料、食品、环境等方面均有广泛应用。利用SPR传感器研究的典型生物体系有：蛋白质、DNA、细胞、药物和酶[36][37]等体系。

基于上面的介绍，我们知道纳米等离子体具有特征的局域表面共振现象（LSPR），纳米等离子体传感器的原理就是基于金属纳米粒子的LSPR，以2015年化学通讯上的啊一篇文献[40]为例，文献中制备了C60@AuNPs等离子体，并将

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它用于催化Fenton反应。创新之处是运用催化剂C60@AuNPs的等离子体共振光谱在催化反应中的摇摆，发现摇摆频率与氧化还原有机物的反应速率直接相关，用于水中污染物有机物的检测。如图1.8，在催化反Fenton的反应过程，氧化态的零价Au对应图1.9（a）中的一个共振吸收光谱，当氧化态Au0作为催化剂，在传递电子的过程中变成还原态的三价金，而Au3+又对应着图1.9(a)中另一个共振吸收光谱。等离子体的纳米金在催化的过程中，氧化态与还原态交替出现，等离子共振吸收峰也来回摇摆。这种共振吸收峰来回摇摆的频率与反应的速率成正相关，而反应的速率又和反应物中氧化剂、还原剂浓度以及温度相关，当反应物中氧化剂过量时，在同一温度条件下，纳米等离子体共振吸收峰的摇摆频率就和反应底物有机物的量相关。据此，就可以用于检测有机物。

图1.8Fenton反应中等离子体监测示意图，基于催化剂纳米金等离子体共振频率的电子传递周

期（颜色变化表示）

Fig1.8. Schematic illustration of plasmonic monitoring of the Fenton reaction. Cycle of electron transfer through the gold nanoparticle-based catalyst rocks plasma resonance frequency of the

nanoparticle (indicated by colour change)[40].

图1.9(a)在反应初期纳米金共振吸收峰的摇摆。（b）共振吸收峰波长的位移。 Fig.1.9 (a)Plasmonic swing during the initial period of reaction. (b) Shift in plasmonic peak

wavelength(Dlmax)[40].

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纳米等离子体传感器的原理如文献中所述，即是应用纳米等离子体做催化剂或者反应物时，随着反应中纳米等离子体的状态（价态、形貌、尺寸、周围环境）的改变，等离子体共振吸收光谱也相应的变化，根据这种变化我们可以间接反映反应中的一些情况。将这种变化与检测物浓度建立关系，根据这些等离子体共振吸收峰的变化检测物浓度。再利用信号转换系统可以将被检测物的浓度直观的表现出来。

1.3.3纳米等离子体传感器研究进展

局域表面等离子体共振（LSPR）重要作用在于其在纳米等离子体传感器方面的应用。由于LSPR对纳米颗粒形状、大小、材料成分、对其周围环境折射率的敏感性，因此，可以利用LSPR的消光光谱或者散射光谱响应周围纳米范围环境变化的信号，如峰强或峰位的改变制作高响应的纳米等离子体传感器。根据纳米等离子体传感器的应用分类，大体可分为基于纳米等离子体的化学传感器和基于纳米等离子体的生物传感器。接下来就具体描述这两种纳米等离子体传感器。

①基于LSPR的化学传感器 1）气体传感器

由于LSPR传感器快速、无标记的特点，使得其不仅在生物界得到广泛发展，在化学传感应用方面也受到重大关注。尤其是在有机气体方面，提出了各种各样的LSPR传感方案。有人设计了以气体形式存在的挥发性有机物的LSPR传感器[41]。起初是将这些化合物吸附在银或金纳米粒子基质上，然后通过峰值波长和粒子消光的总数量来实现对被测物的监测，并且可以迅速、可逆的获得信号。后来这些研究者又报道了一种特殊、多路复用的传感器[42]。如图1.10所示，它是各个目标有机物亲和力不同的三种自组装单分子层（SAMs）功能化的三种类型粒子的传感器。利用多层基质的原理，他们检测了具有不同响应模式的九种气体。

也有人提出了另外一种用聚苯乙烯磺酸（PPS）和聚苯乙烯（PS）包覆蒸发后的基于LSPR金膜的气体传感机理[43]，如图1.10所示。这些暴露于所用各种气体中的聚合物凸起或褶皱影响了局部折射率或者是引起了LSPR峰位的变化

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图1.10（a）利用传感器识别二甲苯。（b）Chen等人对九种气体传感器的机理图。 Fig1.10.(a) Using the sensor to differentiate xylene. (b) Scheme of the nine-gas sensor of Chen et al.

2）pH传感器

纳米等离子体与pH敏感的聚合物相结合可用在解释各式各样的pH传感机制

[44]

。在相关文献中设计了基于pH敏感的共聚物（PMAA-b-PNIPAM）修饰的球状

纳米金的pH传感器。聚合物包覆的粒子悬浮在水溶液中，当pH介于5-8时就会聚合成聚合物。

另有文献报道了基于等离子体晶体的pH传感器[45]。这种等离子体晶体由图案化的480nm纳米阱特性的聚合物层上面覆盖金纳米薄膜构成。随后基质由丙烯酸（AA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）交联剂、光敏引发剂（PI）、甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）水玻雷吉58表面活性剂形成的水凝胶包裹。这种水凝胶随着pH的增加会膨胀起来，进而降低了它的密度，因而导致折射率减小和投射光谱中多重LSPR峰蓝移。这种机制在pH介于1.44-7.86时都是有效的，如图所示。pH的测量是基于投射的累积强度，而不是峰值波长。尽管作者推断基于噪音水平pH的精确度可能会达到0.0001，但此种方法只使得pH的单位精确到0.1.这是由于这种方法是以基质为基础的，并不能依赖聚合作用，因此传感机制是可逆的。

另外一个相关的基于纳米粒子的方法是Jiang等人报道的以任意导向的基质为基础的新月形金的pH传感器[46]。它是由一种以基质为基础的新颖印刷方法制备的新月型金和pH敏感的聚合物2-羟乙基甲基丙烯酸酯（聚合物-HEMA）的水凝胶包裹制备而成的。这种传感器的pH精度可达到0.045的单位，并且水凝胶包裹的基质相当稳定，以致存储一个月后还可实现重复性的测试。

3）其他传感器

LSPR传感器也用于检测水溶液中的氨。这种方法是银纳米粒子在聚合物甲基丙烯酸（PMA）存在下通过UV紫外光照射合成的[27]。此种方法制备的粒子在氨加入后会出现LSPR峰位和颜色明显的变化，这归因于银在银纳米粒子和Ag（NH3）

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2+离子之间的转换，从而导致了粒子大小和形状的变化。

Choi等人设计了基于等离子体共振能量转移的用于检测铜离子的纳米等离子体传感器[48]。在此项机制中，金纳米粒子由能与铜离子形成复合物的特殊配体包裹而成。真是由于这种金属-配体复合物与纳米等离子体共振的电子吸收相符合，它们才被人们选择使用。结果表明铜离子在1nM的浓度时会发生纳米粒子散射的猝灭。

还有Bhatt等人设计了基于被酰亚胺发色团功能化的金纳米球用来实现对铜离子检测的荧光和比色传感器[49]。在铜离子存在的情况下，燃料分子在金纳米粒子表面自由活动，减少了猝灭而增加了荧光强度。与此同时，样品的吸收强度也增加了，加之，纳米粒子的解偶联作用和发色团吸光作用使得峰位发生了红移。虽然这不是严格意义上的LSPR传感器，但却是纳米等离子体传感器应用中一十分有趣的例子。

②基于LSPR的生物传感器

LSPR传感的很多方面都明显表现出与生物学实验、医学实验的高度匹配性。很多研究者已经报道了基于LSPR传感的生物实验，并且描述了它们的特性。这里我们通过识别与受雇者的相互作用和考虑影响灵敏度的其他原因来讨论它们。

1）生物素-链霉素亲和素传感器

现代的生物分析中，由于生物素和链霉亲和素之间可以形成坚固、特殊的连接健，因此，我们可以测出生物素-链霉亲和素之间的相互关系。生物素是很小的有机分子，它可以修饰于纳米粒子表面，而分子量更大的链霉亲和素和素蛋白的折射率也可被检测到，所以生物素-链霉亲和素适合用于LSPR传感器的应用。许多报道中都提到基于LSPR的生物素-链霉亲和素的相互关系。他们的灵敏度可达到M mol/L-u mol/L。

2）抗体-抗原传感器

LSPR传感器在许多免疫文献中都有提到[50][51][52][53]。捕获的抗体可以通过标准生物连接器或者SAM连接到纳米粒子表面，大部分报道都表征了基于剂量-响应曲线的灵敏度。而这些被提到的灵敏度都是依靠结合常数和信噪比率得到的。大部分基于LSPR的报道都没有描述无标记分析的主要优势，即实时相互作用动力学。图1.中剂量-响应曲线就是使用LSPR传感器作为一个终点实验的结果，也是与其他终点实验做了一个有效对比实验。为了进一步实现LSPR分析的潜能，实时相互作用动力学也将会被检测和分析。但是对于生物素-链霉亲和素传感器来说不现实，这是因为生物素-链霉亲和素之间的吸引力太强了，致使通过扩散的结合动力学受到和不结合动力学速度太慢。然而，抗体-抗原动力学则有着更合适的速率，因此，在其他无标记方法中也常被用作研究使用，比如SPR[][55]。图1.中就展示了基于LSPR的金纳米棒连接的抗体-抗原传感器的动力学研究。

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图1.11抗体和特定抗原之间的实时结合动力学。抗体和抗原相互作用间拟合高亮部分收益的

修正动力学参数

Fig1.11.Real-time binding kinetics between antibodies and a specific antigen.Fits to the highlighted

portion yield correct kinetic parameters for an antibody antigen interacrion.

3）其他生物分子相互作用的传感器

LSPR传感器除了探测生物素-链霉亲和素，抗体-抗原的相互作用外，还常被用于勘察生物分子之间的相互作用关系，其中包括核酸分子杂交、蛋白质-碳水化合物、细胞色素-抑制剂、适配子-蛋白质、霉素-受体之间的相互作用关系。一些LSPR生物分析中也尝试了复合流体的研究，如血清和全血。

有报道基于金包裹的纳米粒子阵列用于无标记DNA杂交的测量[56]。他们研究了与角膜失养症有关的BIGH3基因突变，检测了四种单点突变的基因变体，其检测限低到1pM。在蛋白质-碳水化合物相互作用中，LSPR传感器用于研究与植物凝集素中的刀凝集素（ConA）的结合。Yonzon工作组证实了基于银的LSPR传感的甘露糖功能化的豆凝集素（ConA）。Morokoshi等人同时也发明了一种金纳米球功能化的葡萄糖导向的高分子聚合物链的方法[57]。他们通过LSPR传感研究了刀豆凝集素（ConA）与葡萄糖的链接，测量超过6个数量级的动力学靶浓度，其检测限也达到了1.9nM，如图1.所示。

另一个生物分子相互作用的典型例子是通过LSPR传感研究了小药物分子与细胞色素的结合。这些研究都是基于Haes等人提出的分子共振附近的LSPR传感方法。但LSPR峰发生了更大的红移[58]。在Zhao等人的实验中银纳米粒子被药物代谢和激素合成中重要的血红素蛋白细胞色谱P450功能化。细胞色素分子在可见光范围内有吸收谱带，与樟脑的结合吸收光谱会发生蓝移，与咪唑结合会使吸收光谱发生红移。这些现象是由于它们吸收峰与粒子的LSPR峰发生重叠，伴随而来的是纳米粒子消灭的红移或者蓝移，如图所示[59]。

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图1.12细胞色素分子振动附近的LSPR传感

Fig1.12.LSPR sensing near molecular resonance of cytochrome

1.4本课题的研究目的、内容及创新点。

1.4.1研究目的

葡萄糖浓度的分析与检测广泛应用于食品工业、生物加工、环境科学、生命科学等多个领域。特别是经济社会的高度发展，人们对自身身体健康的重视，加上糖尿病发病率极高。人们迫切需要一种能够无创、实时、快速检测的微型葡萄糖监测仪器。同时随着科技的发展，采样、样品预处理、仪器分析等分析流程的传统检测手段的弊端越来越明显，HPLC和高效气相色谱以及旋光法等都需要中大型仪器，预处理不仅复杂，而且检测成本较高。人们已经不满足与传统的检测手段，因此在这样的背景想，葡萄糖传感器的应运而生，它的研发备受关注。葡萄糖传感器不但具有方便、经济、实时、灵敏、快速等优点，而且还具有较好的应用前景。

本课题将纳米金的类葡萄糖氧化酶的活性与等离子体局域表面共振现象相结合，LSPR共振摇摆频率反应氧化反应速率，就可以反映葡萄糖浓度。可构建实时、连续、快速的葡萄糖浓度监测传感器。并将其运用于葡萄糖等的检测上。同其他生物传感器一样，葡萄糖传感器主要由两部分构成。本课题构建的葡萄糖传感器的这两部分分别是葡萄糖浓度的识别系统（玻璃检测池中金纳米酶等物质构成的体系）、化学信号的转换成电信号的转化系统（紫外可见微型光谱仪）。

1.4.2研究内容

本课题的研究主要分为以下三个部分：

①建立以金纳米酶为识别系统核心的，微型紫外可见光谱仪为信号转换系统的纳米等离子体传感器。

②优化传感器的传感测试条件，并运用构建的纳米等离子体传感器检测葡萄

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糖、尿酸等，测试出本传感器传感葡萄糖浓度范围、最低检测限、灵敏度等评价传感器的性能的系列数据。

③将传感器用于葡萄糖、尿酸的检测，并评估纳米等离子体的传感准确度和精密度。

1.4.3创新点

葡萄糖传感器的研究并不始于本课题，在传统的葡萄糖传感器中有两类，一类是将纳米金与比色实验结合的无葡萄糖氧化酶的无酶传感器，这类传感器的特点是检测范围有限，灵敏度不高。另一类是将纳米金和葡萄糖氧化酶结合运用于电极的酶类传感器，此类传感器虽然葡萄糖监测范围变宽，灵敏度也大大提高，但是它高度依赖于葡萄糖氧化酶的活性，首先成本高其次是酶运输和保存条件苛刻不稳定，且容易中毒，对检测样品的预处理要求高。本课题中构建的葡萄糖传感器结合这两类传感器的优缺点，创新性的提出运用人工酶纳米金的局域等离子体共振现象，利用微型光谱仪作为信号采集系统，将葡萄糖浓度和纳米金的LSPR共振频率联系起来。其次是制备小尺寸的纳米金同时，重要的是成功解决了小尺寸纳米金在光谱仪中信号不灵敏等问题，因为纳米金的尺寸越小，类葡萄糖氧化酶的酶活性也更高，但是小尺寸纳米金等离子体共振吸收光谱却平坦，共振吸收光谱会直接影响葡萄糖传感器的信号转换系统也就是会影响传感器的灵敏度。课题中解决了这一问题，在保证传感器的灵敏度的前提下，将纳米金的尺寸做小，增大传感器的检测范围。

重庆大学硕士学位论文 2 基于金纳米等离子体催化传感葡萄糖的检测

2 基于金纳米等离子体催化传感葡萄糖的检测

2.1引言

根据研究目的，致力于研究稳定、实时、灵敏的纳米等离子体传感器。在纳米金做类葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的比色反应为基础，基于纳米金的纳米等离子体共振吸收创建和构造纳米等离子体葡萄糖传感器。这部分将重点放在构建纳米等离子体葡萄糖传感器上，并且优化传感测试条件如温度、pH。以及葡萄糖传感器的性能如选择性、抗干扰等情况。用等离子体葡萄糖传感器检测葡萄糖，并用准确度和精密度评价传感器。

2.2实验内容

2.2.1实验药品与仪器

表2.1化学试剂 Table2.1 Chemical&Reagents

化学试剂名称氯金酸

2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）过氧化物酶来源于辣根（HRP）葡萄糖果糖核糖半乳糖尿酸硼氢化钠柠檬酸三钠磷酸氢二钠磷酸二氢钠氢氧化钠

C6H12O6 C6H12O6 C4H9O4CHO C6H12O6 C5H4N4O3 NaBH4

分析纯西格玛奥德里奇贸易有限公司分析纯国药集团化学试剂有限公司分析纯国药集团化学试剂有限公司分析纯国药集团化学试剂有限公司分析纯国药集团化学试剂有限公司分析纯国药集团化学试剂有限公司分析纯重庆川东化工集团

分子式 HAuCl4•4H2O C18H24N6O6S4

规格

生产厂家

分析纯西格玛奥德里奇贸易有限公司分析纯西格玛奥德里奇贸易有限公司

Na3C6H5O7•2H2O 分析纯重庆川东化工集团 Na2HPO4 NaH2PO4 NaOH

分析纯重庆川东化工集团分析纯成都市新都区工业开发区分析纯成都市新都区工业开发区

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表2.2实验仪器 Table2.2 Laboratory apparatus

仪器名称磁力搅拌器磁力搅拌恒温水浴锅超声波清洗仪恒温干燥箱数显分析天平紫外-可见分光光度计微型紫外-可见分光光度计

仪器型号 JB-1A SZCL-3B KQ-50E DUG-9037 ES-60J UV-2450 FLA6000

生产厂家

上海雷磁仪器制造厂巩义市予华仪器有限责任公司天津市恒奥科技发展有限公司上海精宏实验设备有限公司沈阳龙腾电子称量仪器有限责任公司日本岛津公司杭州晶淮科技有限公司

2.2.2金纳米等离子体的制备

本课题以不同尺寸的纳米金粒子作为纳米酶，作为整个实验的重要部分，我们采用常用的简单的溶胶-凝胶法制备直径分别为3.5nm、5nm、10nm的金纳米粒子。具备步骤如下：

①3.5 nm金纳米粒子[69]

1）储备液配制：4%氯金酸（HAuCl4•4H2O ）溶液：用万分之一的分析天平称取1.0000g的HAuCl4•4H2O橙黄色固体于25mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，转移至试剂瓶中备用；

2）配制0.1M NaBH4溶液：称取NaBH4固体0.0946g于25mL容量瓶中，冰水定容至刻度线，转移至试剂瓶中待用。

3）配制0.1M 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠固体0.7352g于25mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，转移至试剂瓶中待用。

4）制3.5 nm金纳米粒子：于试剂瓶中分别加入10mL蒸馏水、26uL 4% HAuCl4•4H2O储备液、25 uL 0.1M 柠檬酸钠溶液、300 uL新配 0.1M NaBH4溶液，最后搅拌5h。注意边加边搅拌，并且每加一种试剂，都充分搅拌5min，再滴加其他试剂。滴加过程中溶液由无色到淡黄色，慢慢变成橙色，最后逐渐变成红色。

②5nm 金纳米粒子[70]

1）配制38.8mM柠檬酸钠溶液：称取0.2853g的柠檬酸钠固体于25mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，转移至试剂瓶中备用；

2）配制含0.075% NaBH4的38.8mM柠檬酸钠溶液：称取0.2853g的柠檬酸钠固体于25mL容量瓶中，再称取0.0190g NaBH4固体于同一容量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，转移至试剂瓶中待用。

3）制5 nm金纳米粒子：于试剂瓶中分别加入30mL蒸馏水、88uL 4%

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HAuCl4•4H2O储备液、667 uL 38.8mM 柠檬酸钠溶液、334 uL含0.075% NaBH4的38.8mM柠檬酸钠溶液，最后搅拌2h。注意边加边搅拌，并且每加一种试剂，都充分搅拌5min，再滴加其他试剂。滴加过程中溶液由无色变成红色。

③10nm金纳米粒子[71]

1）配制2.2mM柠檬酸钠溶液：称取0.0323g的柠檬酸钠固体于50mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，转移至试剂瓶中待用。

2）制10 nm金纳米粒子：将上述50mL 2.2mM柠檬酸钠溶液转移至三颈瓶中，加热冷凝回流并边搅拌直至沸腾后，滴加86uL的4% HAuCl4•4H2O储备液，后停止加热，持续搅拌直至冷却至室温。溶液由黄色渐变成粉红色最后至血红色。

图2.1不同尺寸的 AuNPs实物图，从左至右分别是3.5nm、5nm、10nm。 Fig.2.1Picture of real products of 3.5nmAuNPs、5nmAuNPs、10nmAuNPs

2.2.3金纳米等离子体的类葡萄糖氧化酶活性及传感条件的优化

①比色法验证金纳米酶具有葡萄糖氧化酶的活性

在玻璃测量池中，以此加入去离子水、5nm的AuNPs、PB缓冲溶液、葡萄糖在37℃下孵化5min，然后加入HPR溶液和ABTS，再测其光谱。同时在氮氛和氧氛中进行对照实验，分析氧气含量对反应的影响。

②构建等离子体传感体系和验证等离子体响应

生物传感器由传感识别系统和信号放大转换系统构成。本课题中的纳米等离子体葡萄糖传感器的传感识别系统是在容积为3mL的玻璃测量池中，利用最初五分钟内，通过纳米金的葡萄糖氧化酶活性催化氧化传感葡萄糖来识别葡萄糖。而信号转换系统是利用微型光谱仪，将在催化过程中纳米金的LSPR共振吸收峰的来回摇摆的摇摆频率将葡萄糖浓度信号转化为电信号。构建的传感器如图2.2所示。在玻璃池中，以此加入去离子水、5nm的AuNPs、PB缓冲溶液、葡萄糖，在37℃下，看金纳米酶催化葡萄糖的等离子体共振吸收频率是否发生周期性波动。

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图2.2构建纳米等离子体葡萄糖传感器的测量装置示意图。

Fig2.2.Schematics of the measurement setup for plasmonic monitoring of glucose.

为了达到更好的传感性能，对传感器进行优化，如纳米酶的尺寸和浓度，传感的温度和pH等，做了如下系列实验：

③AuNPs尺寸的选择：

在测量池中分别注入1.6mL去离子水，20uL pH=8的PB溶液，10uL 1M葡萄糖溶液（CGlu。=5mM），363uL 0.275mM 的AuNPs（d=3.5nm、5nm、10nm，CAu=0.05mM），在37℃下，孵育5min，同时检测其Au的等离子共振吸收峰的波动频率。然后分别加入200uL过氧化物酶（HRP）和200uL的ABTS溶液。加入HRP和ABTS工作液后，测溶液光谱。并与空白实验进行对比。

④AuNPs浓度的选择：

在玻璃测量池中，分别注入1.6mL去离子水，20uL pH=8的PB溶液，10uL 1M葡萄糖溶液（CGlu。=5mM），363uL 0.275mM 的AuNPs（d=5nm，CAu=0.05mM，0.1mM，0.15mM），在37℃下，孵育5min，同时检测其Au的等离子共振吸收峰的波动频率，然后分别加入200uL过氧化物酶（HRP）和200uL的ABTS溶液。加入HRP和ABTS工作液后，测溶液光谱。

⑤温度的选择

保持纳米金的浓度为0.05mM，葡萄糖浓度为5mM，pH=8，传感温度分别为17℃、27℃、37℃、47℃，在5分钟内纳米金传感等离子体共振吸收峰的摇摆频率。具体操作：在反应器中分别加1.91mL H2O，30uL pH=8 PB缓冲液，10 uL 1M Glu.，50uL 0.25mM Au（5nm），置于烘箱中，设置温度为17℃，同时测5分钟内纳米金传感等离子体共振吸收峰的摇摆频率。其它温度类似操作。

⑥pH的选择

保持纳米金的浓度为0.1mM，葡萄糖浓度为5mM，传感温度为37℃，pH分别为5、6、7、8、9。并在5分钟内纳米金传感等离子体共振吸收峰的摇摆频率。具体操作：在反应器中分别加1.91mL H2O，30uL pH=5缓冲液，10 uL 1M Glu.，

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50uL 0.25mM Au（5nm），置于烘箱中，设置温度为37℃，同时测5分钟内纳米金传感等离子体共振吸收峰的摇摆频率。其它pH值类似操作。

⑦多因素的交互作用

由于存在多个优化因素，故需考虑存在相互影响的交互作用。为验证多因素之间是否存在交互作用，首先用正交实验设计，对纳米金的浓度、反应的pH、和温度等反应条件是否存在交互作用（由于已有对纳米金尺寸和含氧量的工作，故在此并未再做进一步说明）。选择适合四因素三水平的L9（34）正交表。根据实验方案在测量池中注入相应浓度的5nmAuNPs，PB缓冲溶液在相应的温度下，孵化五分钟，同时检测纳米金的共振吸收光谱的共振频率。

表2.3条件优化实验方案

Table2.3.Condition optimization experimental scheme

实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

A（CAu）

1 1 1 2 2 2 3 3 3

空列 1 2 3 1 2 3 1 2 3

B（pH）

1 2 3 2 3 1 3 1 2

C（温度）

1 2 3 3 1 2 2 3 1

实验方案 A1B1C1 A1B2C2 A1B3C3 A2B2C3 A2B3C1 A2B1C2 A3B3C2 A3B1C3 A3B2C1

（根据前面简单比较方法，取用每个因素水平1、2、3分别是CAu =50、100、150uM，pH=6、

7、8，T=27℃、37℃、47℃。）

2.2.4金纳米等离子体催化传感葡萄糖

用优化后的纳米等离子体传感器检测一系列浓度的葡萄糖，同时进行比色对照实验，具体操作如下：

①试剂准备

首先配制过氧化物酶（HRP）溶液：称取HRP固体10mg于10mL的容量瓶中，用pH=7.5，0.1M的磷酸盐缓冲液（PB）定容。其次配制20mM的ABTS溶液：首先配制pH=7.5，0.2M的磷酸盐缓冲溶液（PB）10mL，称取109.7mg ABTS固体，加入10mL的容量瓶中，用pH=8,0.2M的PB液定容至刻度线。

②检测葡萄糖实验

在玻璃测量池中，分别加入相应的液体后使CAu=0.1mM，在37℃下孵育5分

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钟，并同时测五分钟内的ROCK值。最后取出测量池分别加入200uL的HRP和ABTS工作液并测其光谱。葡萄糖浓度分别为0、0.1mM、 0.3mM、0.5mM、0.7mM、0.9mM、1mM、3mM、5mM。

③纳米等离子体传感器性能测试 1）葡萄糖检测的选择性实验

为了研究金纳米等离子体是否只对葡萄糖响应，在相图的实验条件下，用果糖、核糖、半乳糖代替葡萄糖做了几组对照实验。所用的葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖等浓度均为0.1mM,其它实验步骤与葡萄糖检测实验类似，这里不再进行赘述。

2）葡萄糖检测的干扰实验

在人体血清和尿液中，除了葡萄糖外，还存在抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）等物质。而AuNPs对这些物质也可能存在催化活性。为了评估传感器的选择性，对这些可能起干扰的物质进行干扰实验。血清中葡萄糖的正常生理水平是3-8mM，而检测物的浓度至少要三倍于干扰物浓度或最高预期浓度，故可以用100：1和10：1的摩尔比来评估抗坏血酸和尿酸对葡萄糖传感过程产生的干扰。首先在检测池中加入混合物（混合物1：1mM葡萄糖和10uM的AA，混合物2：1mM葡萄糖和100uM的AA，混合物3：1mM葡萄糖和10uM的UA，混合物4：1mM葡萄糖和100uM的UA），pH=8的磷酸盐缓冲液，5nm纳米金，然后在37℃环境下，测五分钟内ROCK。

2.2.5模拟样品检验

为了检验此葡萄糖测定方法的准确度与精确度，模拟真实样本，用构建的纳米等离子体葡萄糖传感器测其葡萄糖回收率的实验，并重复检测3次，研究检测方法的精密度。具体的在pH为8的缓冲溶液中相应浓度的葡萄糖、尿素、尿酸、无机盐等。首先配备尿素1.8%，尿酸0.05%，无机盐1.1%的模拟尿液原液；然后将模拟尿液原液稀释至原来的100倍；其次在稀释后的样品中加入葡萄糖，浓度分别为：0.350 mM、0.650 mM、0.750 mM、0.950 mM、1.350mM；最后测模拟样品中葡萄糖的浓度，并重复检测3次。

2.3结果与讨论

2.3.1AuNPs的表征

①紫外-可见吸收光谱

由图可知，制备3.5nm、5nm、10nmAuNPs的共振吸收峰分别在504nm、510nm、520nm，随着金纳米粒子直径的增大，AuNPs的共振吸收峰出现一定的红移。而且从实物照片中也可以看到，随着直径的增大，溶液的颜色由粉红色渐变成血红色。

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图2.3虚线是现制得不同尺寸AuNPs紫外-可见吸收光谱，实线是存放一月后的紫外-可见光谱。 Fig.2.3 Absorption spectra of different diameters AuNPs, Solid line: fresh prepared citrate-stabilized

Au NPs; Dash line: after a month of storage. The inset is the photographs of the AuNPs.

②TEM分析

制备得3.5nm、5nm、10nmAuNPs的实物照片如图2.1，并用TEM对形貌和尺寸进行分析，结果如图2.4。图(a)-(c)为新制的尺寸分别为3.5nm、5nm、10nm，图(d)-(e)是存放一个月的尺寸分别为3.5nm、5nm、10nm的TEM相貌图。由表征的TEM图可见制备得到的是分散性良好的球状颗粒。即使在存放一个月后，也没有出现明显的凝聚现象。并且与文献中的描述的尺寸相符，制备得到直径分别是3纳米、5纳米、10纳米的分散性良好稳定的球形AuNPs。

图2.4(a)-(c)分别是3.5nm、5nm、10nmAuNPs的TEM图；(d)-(f)存储一个月后的3.5nm、5nm、

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10nmAuNPs的TEM图

Fig 2.4 The TEM images of the AuNPs. (a)-(c) 3.50 nm, 5.00 nm,10.0 nm AuNPs;(d)-(f) the TEM

image of the Au NPs after a month of storage: (d) 3.50 nm; (e) 5.00 nm; (f) 10.0 nm.

2.3.2金纳米等离子催化传感条件的影响

在构建纳米等离子体葡萄糖传感器的过程中，发现影响传感器性能的因素除了AuNPs的尺寸和浓度外，还有催化反应的环境（如有氧或者无氧等）和条件（pH和温度）。首先对纳米金的尺寸和浓度，以及有氧无氧的催化环境进行了探索。因为前人已有的大量试验证明：对于纳米金的葡萄糖氧化酶活性与纳米金的尺寸成反比，与纳米金的浓度成正比。并且得到其他科研工作者的证实。这里我们只用比色反应加以验证，而并未用AuNPs的LSPR共振吸收峰的摇摆频率。实验结果如图2.5所示。可以证实纳米金的拟葡萄糖氧化酶的催化活性与纳米金的尺寸和空气中氧气的含量密切相关。当纳米金的尺寸越小，催化活性越高；氧气含量越高，催化活性越好。

图2.5（a）不同尺寸的AuNPs的催化活性：黑实线是3.5nm，红实线是5nm，蓝实线是10nm，紫色实现是空白对照。（b）5nmAuNPs在不同的氧含量中的催化活性：蓝实线是在氧氛中，红

实线是在空气中，黑实线是在氮氛中。

Fig2.5. (a) The catalytic activity of Au NPs with different size: black curve for 3.50 nm NPs, red curve for 5.00 nm NPs and blue curve for 10.0 nm NPs. The purple line is the control experiment. The inset is the photograph of the colorimetric reaction. (b) The catalytic activity of 5.00 nm Au NPs under anaerobic and aerobic condition: blue is in O2, black is in N2 and red is the reference condition

(in Air).

在对基于纳米金等离子体传感器的传感条件的探索中，做了纳米金的尺寸和

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纳米金的浓度对传感器传感性能的实验。结果如图2.6，（a）是纳米金尺寸的影响，可以发现，随着纳米金尺寸的增大，传感器的传感频率越小，传感性能越差，实验结果与比色实验的光谱图结果相符。三个尺寸中，3.5nm纳米金的LSPR共振频率是0.43Hz，10nm纳米金的LSPR共振频率是0.03Hz。可是随着纳米金直径的增大，金纳米粒子也越来越稳定，但类葡萄糖氧化酶的活性逐渐减小。但对于传感器的灵敏度、成本、纳米金的稳定性综合考虑因素，本论文中还是采用了5nm的纳米金，因为5nm的纳米金已经能满足催化活性以及传感器的灵敏度等各方面的要求。图2.6（b）是纳米金浓度的影响，取了三个水平的纳米金浓度，分别是50uM，100uM，150uM。随着浓度的增加，纳米金的LSPR共振频率越来越大。基于微型光谱仪的的仪器误差，当最大吸光度在0.5-1.5之间是误差较小，并且100uM的共振频率与150uM的共振频率相差不大，所以最终选择的AuNPs浓度为100uM。

图2.6(a)不同尺寸的AuNPs的共振频率。(b)5.00nm AuNPs的浓度对的共振频率的影响。 Fig2.6 (a) Size-dependent plasma resonance frequency. (b) The influence of 5.00 nm Au NPs with

different concentration to the plasma resonance frequency.

Beltrame等人在文献[74]中说金纳米颗粒的催化氧化葡萄糖的反应在较高温度下更快。在我们的传感体系中，对AuNPs作传感器的传感条件温度做了研究实验，虽然我们最终采用的是5nm金和模拟人体体内温度37℃，但是如图2.7（a）所示，特征吸收峰的摇摆频率随着温度的升高，传感频率从0.139Hz增加到1.279Hz。与Beltrame等人描述相符。为了探索和优化传感系统的催化条件，测量了一系列pH值下的信号响应频率。如图2.7（b）所示，在pH为5时，出现最小摇摆频率0.598Hz，随着pH值的升高，反应速率加快，摇摆频率逐渐增大，在pH值为8时，达到最大摇摆频率0.826。但是摇摆频率并没有进一步增大，而是在pH值为9的时候，摇摆频率要小于pH值等于8的时的摇摆频率。这主是因为在强酸或者强碱的环境

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中，葡萄糖氧化受到抑制。正如Abbadi在文献[75]中所述，当在pH值较低或者不调pH值时，葡萄糖氧化反应受到的抑制作用快速发生。尽管在碱性环境中，有助于葡萄糖的氧化反应，但在强碱环境中，快速反应产生的氧化还原产物葡萄糖酸，可能会如Fan及其同事在文献[7]中所描述的一样，随着反应的进行，葡萄糖氧化产生氧化产物变慢主要归因于产物葡萄糖酸代替柠檬酸根被吸附在纳米金的表面，由于金纳米粒子表面的覆盖，活性位点变少，反应会自我。与这种自我解释不同的是，Liu团队[76]提出，当反应体系中出现额外的葡萄糖酸盐时，在pH值超过8时，葡萄糖酸盐对葡萄糖氧化反应的抑制作用开始出现。这种现象可能是由于在强碱性条件下，金纳米粒子表面吸附了羟基离子，导致金表面活性位点减少，反应变慢。总之，无论是哪种原因，在我们的体系中出现了同样的想象。但是本体系的信号采集是在反应的前五分钟内，可以一定程度的减少这种自我的情况，除非在极大的pH值下。

图2.7 AuNPs作传感器(a)摇摆频率与温度的关系；（b）摇摆频率与pH的关系 Fig2.7.AuNPs as a sensor.(a)Dependence of plasmonic cycle on reaction temperature.

(b)Dependence of plasmonic cycle on solution pH

为了验证因素间是否存在交互作用，采用整齐可比、均衡分散的正交设计实验方案。其实验结果如表2.3所示，对于极差从大到小依次是AuNPs浓度列极差、温度列极差、pH列极差、空白列极差，分别是1.886、1.105、0.908、0.351。说明针对实验的三个因素，对实验结果影响最大的是AuNPs的浓度，其次是温度，最后是pH值。空白列极差可以反映随机误差、因素间的交互作用或某个忽略了对实验结果有重要影响的其他因素，也常被称为误差列。表中误差列的极差的两倍还小于最极差，故可以说，实验结果可靠、实验的三个因素之间并且不存在协同的交互作用。所以单因素分析法的结果可信，在选出的优方案A2B3C1与前面结果相符。

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表2.4条件优化实验方案及实验结果分析

Table2.4.Condition optimization experimental scheme and analysis of experimental results

A（CAu/uM）

B（pH）

C（T/℃）

共振频率（Hz）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 极差R 因素主→次优选方案

50 50 50 100 100 100 150 150 150 2.446 4.332 4.269 1.886

1 2 3 1 2 3 1 2 3 3.748 3.374 3.725 0.351

6 7 8 7 8 6 8 6 7 3.183 3.773 4.091 0.908 A C B

A2B3C1（CAu=100 uM，pH=8，T=37℃）

37 27 47 47 37 27 27 47 37 4.163 3.058 3.826 1.105

0.831 0.568 1.047 1.256 1.682 1.394 1.096 1.523 1.65

2.3.3金纳米等离子体催化传感葡萄糖

图2.8纳米等离子体共振频率与葡萄糖浓度的关系

Fig2.8. Relationship of the plasmonic frequency with the glucose concentration.

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在使用优化后的实验条件，用金纳米等离子体传感器检测一系列浓度的葡萄糖，图2.8为实验结果。图中显示了纳米金等离子体共振频率随着葡萄糖浓度的变化而逐渐上升。共振频率从0.098Hz增加到1.21Hz。为了和比色法进行比较，在5分钟采集LSPR共振频率后加入HRP和ABTS，看反应的显色反应，溶液颜色逐渐从粉红色到深绿色，并测溶液的紫外可见吸收光谱图，如图2.9(a)所示。随着葡萄糖浓度的增加，溶液颜色越来越深，且光谱的最大吸收峰越来越大。图(b)是扣除空白后，最大吸收峰的变化量（△A）与葡萄糖浓度的拟合关系图。

图2.9（a）比色法的显色剂吸收光谱；（b）比色法中吸光度与葡萄糖浓度的关系 Fig2.9.(a) Colorimetric absorption spectroscopy,(b) The relationship between absorbance and

glucose concentration in colorimetry.

表2.5纳米等离子体传感器法与比色法的对比

Table2.5. Comparison between Nano Plasma Sensor and Colorimetry

检测方法 LSPR传感器比色法

检测范围(uM) 201×104 3007×103

检测限(LOD)

10uM 80uM

从图2.8和图2.9的拟合结果以及表2.5显示：

①纳米等离子体传感的方法葡萄糖浓度在2mM以内，具有较好的线性；而比色法检测葡萄糖，葡萄糖浓度在1.4mM以内，具有较好的线性关系；纳米等离子体传感器的线性范围更宽，线性更好。

②纳米等离子体传感法相较于比色法更加稳定，特别是在大浓度的葡萄糖检测时，误差也更小，而且纳米等离子体传感器是零背景，故无最低检测限一说，只

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要传感器能识别的信号，即为有效信号，但比色法，由于过氧辣根酶和ABTS本身有颜色，在空白对照实验中，也有吸收峰。

③纳米等离子体传感法比比色法更加经济，无需引入其他试剂，如HPR和ABTS，特别是过氧辣根酶HPR，属于生物酶，较贵且存储条件苛刻，否则易失活。

④纳米等离子体传感法较比色法更快速，检测只需要五分钟；而比色法所需时间更长。

图2.10(a)葡萄糖传感器的选择性，(b)抗坏血酸和尿酸对葡萄糖选择器的干扰测试 Fig2.10. (a) Selectivity estimate of the glucose detecting system. The different in plasmonic cycle between glucose and other substrates. (b) Interference effect test using Ascorbic acid (AA) and uric

acid (UA).

选择性是评估基于金纳米等离子体葡萄糖传感器性能的一个主要因素。使用果糖、核糖和半乳糖来研究在相同条件下的选择性。图2.10（a）用相同浓度的底物做基底测纳米金的共振吸收光谱摇摆频率，表明该系统对葡萄糖具有良好的选择性。选择生物样品中的常见干扰物物质抗坏血酸（AA）和尿酸（UA）来研究传感器系统的干扰效应。如图2.10（b）所示，分别向混合物中加入摩尔比100：1的抗坏血酸和尿酸时，共振吸收光谱摇摆频率的差异基本可以忽略不计。但当分别加入混合物中抗坏血酸和尿酸与葡萄糖的摩尔比为10：1时，会出现明显的干。

2.3.4传感器的准确度和精密度

准确度指在实验条件下多次测定的平均值与真值的相符合的程度，可以评估系统误差的大小，通常用回收率来估计和确定。而精密度则是表示测量的再现性，它是保证准确度的先决条件，一般用相对标准偏差表示。对于回收实验中的葡萄糖浓度的检测结果见下表：

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表2.5准确度和精密度 Fig2.5. Accuracy and precision

加入葡萄糖浓

度 (mM)

1 2 3 4 5

0.350 0.650 0.750 0.950 1.350

测定葡萄糖浓

度（mM） 0.339 0.672 0.769 0.973 1.332

96.9 103.4 102.5 102.4 98.7

2.33 2.27 1.70 2.15 1.98

回收率(%)

RSD，%（n=3）

五个样本的回收实验中葡萄糖浓度的回收率分别是96.9%、103.4%、102.5%、102.4%、98.7%、；而相对标准偏差分别是2.33%、2.27%、1.7%、2.15%、1.98%。可见测定浓度和真实值十分接近，而且测定浓度的偏差范围也较小，由此推断构建的纳米等离子体葡萄糖传感器检测葡萄糖浓度的方法具有较好的精密度和准确度。

2.4结语

在本章的工作中，首先用不同还原性强弱的还原剂制备了三种尺寸的纳米金粒子，并验证了金纳米粒子具有葡萄糖氧化酶的活性，然后成功构建了纳米等离子体传感器。接着对纳米等离子体传感器的AuNPs尺寸和浓度，孵化温度和pH进行优化，最终选择AuNPs的尺寸为5nm，浓度为100uM，温度为37℃、pH为8。最后将优化后的纳米等离子葡萄糖传感器用于检测葡萄糖，并研究其选择性和抗干扰能力。构建的纳米等离子体葡萄糖传感器的检测范围在0.02mM-10mM，检测限为10uM。对单糖核糖和果糖以及二糖麦芽糖进行的选择实验显示，具有较好的选择性。对于尿酸和抗坏血酸的干扰实验显示，当葡萄糖与干扰物的物质的量之比为100：1时，基本没有什么影响。但是当干扰物的量不断增大，到10：1时，出现明显的干扰现象。构建的葡萄糖传感器在监测范围内具有灵敏度高、响应快、实时、低成本等优点，但是传感器使使用的是液体催化材料首先不方便存储，其次后续的传感器传感过程中存在高消耗，而且纳米金易发生聚集而不稳定等问题。

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3 基于金纳米等离子体催化传感尿酸的检测

3.1引言

尿酸是鸟类和爬行类的主要代谢产物，微溶于水，易形成晶体。正常人体尿液中产物主要为尿素，含少量尿酸。尿酸是嘌呤代谢的终产物，为三氧基嘌呤，其醇式呈弱酸式。各种嘌呤氧化后生成的尿酸随着尿液排出体内。在人体血液中尿酸多以醇式形式存在，而在尿液中多以三氧基嘌呤形式存在。正常情况下，人体内每天新生产的尿酸和排泄掉的尿酸的量基本持平，使体内尿酸处于平衡状态。但若产生的尿酸过多来不及排泄或者尿酸排泄机制退化，造成体内尿酸滞留过多，当血液尿酸浓度大于7毫克/分升，导致人体体液变酸，影响人体细胞的正常功能，长期将会引发痛风。健康成人正常尿酸水平为血清中0.150.4mM，尿中149446mM，固尿酸的检测在临床上确诊是否为尿酸过多型尿酸具有重大意义。在前面构建检测葡萄糖体系的实验中，我们发现，当体系中存在尿酸时，检测葡萄糖的体系会受到很大的影响。于是我们大胆的构建一个新的检测尿酸的体系，利用已有的检测葡萄糖体系来检测尿酸。

图3.1尿酸的两种存在形式：（左）三氧基嘌呤（右）醇式尿酸[67]。 Fig3.1. Two forms of uric acid; (left) trioxy purine (right) alcohol uric acid

3.2实验部分

3.2.1实验药品与仪器

除了使用了尿酸（阿拉丁，99%），与第二章实验药品与实验仪器相同。

3.2.2金纳米等离子体催化传感尿酸的响应

用比色法检验证在有尿酸存在时，金纳米酶是否还具有葡萄糖氧化酶的活性，然后用构建的基于LSPR共振频率的葡萄糖传感器检测尿酸，检验传感器是否对体系产生响应。实验前配备所需试剂，特别是用PB缓冲溶液现配置系列所需浓度的尿酸溶液。

①空白实验：分别加入1.61mL去离子水，20uL pH=8的PB溶液，363uL

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0.275mM 的AuNPs（d=5nm，CAu=0.05mM），在37℃下，孵育5min，同时检测其Au的等离子共振吸收峰的波动频率（ROCK），然后分别加入200uL的HRP和ABTS工作液后，测溶液光谱。

②测无尿酸时的比色光谱：分别注入1.6mL去离子水，20uL pH=8的PB溶液，10uL 1M葡萄糖溶液（CGlu.=1mM），363uL 0.275mM 的AuNPs（d=5nm，CAu=0.05mM），在37℃下，孵育5min，同时检测ROCK，然后分别加入200uL HRP和ABTS工作液后，测溶液光谱。

③测有尿酸时的比色光谱：分别注入1.6mL去离子水，20uL pH=8的PB溶液，10uL 1M葡萄糖溶液（CGlu.=1mM），363uL 0.275mM 的AuNPs（d=5nm，CAu=0.05mM），尿酸溶液使测量池中尿酸浓度为10uM，在37℃下，孵育5min，同时检测ROCK，然后分别加入200uL HRP和ABTS工作液后，测溶液光谱。

④对照实验：分别注入1.52mL去离子水，20uL pH=8的PB溶液，100uL 0.2mM尿酸溶液（CUA=20uM），363uL 0.275mM 的AuNPs（d=5nm，CAu=0.05mM），在37℃下，孵育5min，同时检测ROCK，然后分别加入200uL HRP和ABTS工作液并测其光谱。

3.2.3葡萄糖浓度的影响

由于前面已经对传感器中金纳米酶的尺寸和浓度，传感温度和pH进行优化，这里为满足检测葡萄糖的最好性能，固不再进行优化选择。传感器的AuNPs用5nm，浓度为100uM，温度为37℃，pH=8的弱碱环境。对葡萄糖的浓度进行优化选择，选择在葡萄糖检测范围内线性较好的葡萄糖浓度，选择葡萄糖浓度定为3mM、1mM、0.5mM，在同一个葡萄糖浓度下，测系列尿酸浓度。都在pH=8，T=37℃条件下测五分钟内的共振频率。同时，用比色法进行对照实验。

3.2.4尿酸检测

用优化后的条件（葡萄糖浓度为1mM），测系列浓度的尿酸溶液，除了测共振摇摆频率外，还做比色反应，测其光谱。

3.2.5模拟样品检测

配备模拟尿液原液：水95%，尿素1.8%，尿酸0.05%，无机盐1.1%；按照1：100的比例，进行稀释；在样品原液中加入尿素标准品，使浓度分别为15 uM、30 uM、50 uM、70 uM、90uM；用纳米等离子体传感器检测五个模拟样品，每个样品重复检测3次。

3.3结果与讨论

3.3.1检测方法的原理

在纳米等离子体传感器的干扰实验中，鉴于尿酸对传感器传感葡萄糖有影响，

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利用这一现象，将纳米传感器运用于检测尿酸的检测。首先用比色法，再次证实尿酸对传感器的影响。

图3.2尿酸传感活性

Fig3.2.The activity of uric acid sensor.

根据比色实验得到图2.10（a）图为运用葡萄糖传感体系检测尿酸的比色原理图，最大吸收波长为415nm，黑色实线是空白实验，其吸光度为0.423；天蓝色实线是加有10uM尿酸的对照实验，吸光度为0.224；红色实线是加有0.5mM葡萄糖的对照实验，吸光度为2.711；而蓝绿色实线是加有0.5mM葡萄糖和10uM尿酸的实验光谱，吸光度为0.921。从这张图上发现，当只有尿酸的时候，光谱与空白无异，可能由于尿酸会附着于工作液上，使工作液本色的吸光度有所下降，是可以接受。当测量池中只有葡萄糖使，即使葡萄糖传感体系，出现Au类葡萄糖氧化酶的活性，催化氧化葡萄糖，使其分解为葡萄糖酸和双氧水，而双氧水与工作液发生特征的颜色反应，在紫外可见光谱区发生特征吸收。但是当葡萄糖传感体系中加入尿酸后，尿酸与双氧水发生竞争，并优先于工作液结合，使与双氧水发生特征的显色反应的工作液变少，特征吸收的吸光度变小。还有一种可能是在传感葡萄糖浓度的体系中，加入尿酸后，尿酸是对电子的中转站AuNPs产生影响，与文献[7]中葡萄糖氧化产物葡萄糖酸附着于AuNPs上，自我反应类似，尿酸会附着于AuNPs的表面，使AuNPs的催化活性位点减少，催化活性降低。这些猜想还有待证实，但是根据减小的吸光度与加入的尿酸的量的关系的研究，利用葡萄糖传感器体系，可以对尿酸进行检测。

3.3.2葡萄糖浓度的影响

在利用金纳米等离子体传感器检测尿酸的系统中存在多个变量，如AuNPs的尺寸、浓度，传感条件温度、pH，氧气含量，以及葡萄糖的量。尿酸的检测是在

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基于金纳米等离子体葡萄糖传感器的研究，故传感条件温度、pH等的选择应与纳米等离子体传感器的选择一致。值得一提的是，葡萄糖的量对尿酸的检测有很重要的影响，需要特别关注。于是在尿酸的检测中，首先将在不同葡萄糖含量下检测系列尿酸，葡萄糖浓度分别为3mM、1mM、0.5mM，以传感器的LSPR共振频率作为指标进行选择。并用比色光谱作为辅证。

图3.3三个不同浓度葡萄糖条件下纳米等离子体传感器的共振频率和尿酸浓度的线性关系以及比色光谱图：（a）3mM葡萄糖（b）1mM葡萄糖（c）0.5mM葡萄糖（d）1mM葡萄糖条件

下测尿酸的共振吸式光谱图。 Fig3.3. The linear relationship between the resonant frequency and the uric acid concentration of the nano plasma sensor under three different glucose concentrations and the color spectrum;(a)3mM Glu.

(b)1mM Glu. (c)0.5mM Glu. (d) Resonance absorption spectrum of 1mM Glu.

实验结果如图所示，显示不同葡萄糖浓度条件下所测尿酸的线性范围并不相

同，但是都具有较好的线性关系，具体的线性拟合数据结果如表所示。

表3.1不同葡萄糖浓度条件下检测尿酸的线性拟合结果

Table3.1. Linear fitting results of uric acid detection under different glucose concentration conditions 葡萄糖浓度（mM）

50400

-0.2793

线性范围(uM) 截距斜率

相关系数R2 0.991 0.9356

检测限LOD(uM)

12.5 13.8

从表格中可以得出在相同的检测范围的情况下，与比色法相比，纳米等离子体传感器的线性更好，并且检测限也相对更低。

3.3.4准确度与精密度

为了验证方法可行性和正确性，需要用准确度和精密度进行判断，本实验中可通过在真实样本中进行标准加入法研究。所谓标准加入法即是将一定量已知浓度的标准溶液尿酸加入到稀释过滤处理后的血清待测样品中，测定加入前后样品

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的浓度。加入标准溶液后的浓度将比加入前的高，其增加的量应等于加入的标准溶液中所含的待测物质的量。如果样品中存在干扰物质，则浓度的增加值将小于或大于理论之。通过此法可得到加标回收率，计算公式如下：

加标回收率=

加标试样测定值−试样测定值

加标量

×100%

相对标准偏差RSD作为评价方法的精密度的重要的依据，其计算方法如下：

2√∑𝑛𝑖=1(𝑥𝑖−𝑥̅)RSD=×100%

𝑥̅

实验结果如下表

表3.5模拟样本中尿酸的检测和回收

Table3.5.Determination and recovery of uric acid in serum samples 模拟样本

加入尿酸（uM）

1 2 3 4 5

15 30 50 70 90

测得尿酸（uM） 15.9 29.3 50.6 69.8 91.3

106.0 97.7 101.2 99.7 101.4 回收率，%

RSD,%（n=3） 4.6 3.2 2.2 1.4 2.1

从表中数据结果看，五个样本的回收率分别为106.0%、97.7%、101.2%、99.7%、

101.4%，测定值与真实值靠近，固本课题中构建的传感器能成功运用于真实样本的

检测。而相对标准偏差RSD分别为4.6%、3.2%、2.2%、1.4%、2.1%，测定浓度的偏差范围较小，精密度较好。

3.4结语

在本章中，根据上一章节葡萄糖传感器的干扰测试中，葡萄糖传感器受尿酸干扰很大而受启发，利用葡萄糖传感器现象，并构建尿酸传感器。根据上一章节中，优化后的葡萄糖传感器，进行尿酸检测的过程中，发现葡萄糖的浓度对尿酸检测具有重要影响，于是对传感器中葡萄糖浓度进行优化，并将优化后的传感器，

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用于尿酸的检测和真实样本的检测。在对尿酸的检测中，同时还进行了比色法测尿酸，将两种方法进行比较。发现与比色法相比，此方法的线性更好，并且检测限相对更低，LOD为12.5uM。在真实样本的检测中，对此方法的准确度和精密度进行了研究，五个样本的平均加标回收率为101.2%，平均RDS为2.7%，可见此方法具有较好的准确度和精密度。但此传感器测量尿酸存在检测范围较窄的缺点，需将真实样本根据尿酸浓度的估算值，稀释制若干倍，进行检测。除此之外，尿酸干扰葡萄糖传感测试的机理也不清楚，有待探究。

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4 AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜催化传感葡萄糖的检测

4.1引言

针对上述实验中所遗留的关于液体催化剂材料的不稳定及高损耗等问题，后续实验此作出了进一步的优化改进。在本小节中，我们尝试对 Au 纳米酶进行负载处理，并以薄膜的形式将所需传感器件呈现出来并用于葡萄糖的实时原位监测。

4.2实验内容

4.2.1实验药品与仪器

实验药品与仪器除了原硅酸四乙酯（98%，阿拉丁），曲拉通X-100（生化试剂级），正丁醇（99.5%，国药）外，其余与第二章相同。

4.2.2金纳米等离子备

基于前述章节，本实验中我们选用了尺寸更小且酶催化活性更高的小尺寸 Au 纳米粒子（直径为 3.0 nm）作为葡萄糖模拟酶及传感器材料。参考Tierui Zhang团队[72][73]中小尺寸纳米金的制备方法，3nm的纳米金作为核心材料，也是被负载的粒子，我们采用的是在有机溶剂中，油胺做保护剂、甲硼烷-叔丁胺络合物做还原剂，在40℃恒温反应一个小时制备的尺寸为3nm的纳米金粒子。具体操作步骤如下：

①称取 100mg HAuCl4·4H2O 固体粉末，并将其溶解于 10 ml 四氢化萘溶剂中；

②将上述溶液升温至 40 ℃ 并持续搅拌，随后向溶液中快速注入 10 ml 油胺； ③将 43.5 mg 叔丁基胺硼烷溶解至 2ml 油胺-四氢化萘混合溶剂中（二者体积比为 1:1），持续搅拌使其均匀混合；

④将步骤 3）中所配置的混合溶液快速注入步骤 2）中 40 ℃ 恒温下的反应溶液中，该反应溶液颜色立即变为红色，持续搅拌，时间 1 小时；

⑤将上述红色液体缓慢冷却至室温，随后向内注入适量无水乙醇，对所得产物进行离心、清洗，该步骤重复3～5次；

⑥将离心清洗后的产物重新分散至 12 mL 环己烷中，密封备用，至此即制得所需 3 nm 的 Au 纳米粒子（CAu = 21.16 mM）。

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4 AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜催化传感葡萄糖的检测

图4.1实物图

Fig4.1. Picture of real products

4.2.3AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜制备

为便于后续光谱监测，该实验中选用透明玻璃基底作为载体，将所需传感器薄膜覆于基底表面。

玻璃基底处理：

①将玻璃基底按顺序依次浸泡于丙酮、乙醇、去离子水中，并分别进行超声清洗，持续30min，随后在100℃条件下进行烘干；

②将初步清洗过的玻璃基底浸泡于新鲜配置的Piranha溶液（浓H2SO4 : H2O2 = 3:1，v/v）中，浸泡时间2 h，该步作进一步玻璃基底表面的亲水化处理；

③用去离子水反复冲洗玻璃表面，3 ~ 4次；

④将处理完成的玻璃基底浸泡于去离子水中，留以备用。 Au@SiO2纳米等离子体薄膜制备

根据Wang B等人在文献[11]中以环己烷、水、曲拉通X-100和正丁醇的体系中三相图为参照，取两相区点（图4.2红色点）用于制备复合材料，这点表面活性剂TX-100和助表面活性剂正丁醇的比重分别为5%，环己烷的比重为10%、水的比重为80%。在微乳液中，以水解硅酸四乙酯来制备SiO2并以SiO2为载体，将AuNPs负载其上，制备成AuNPs@SiO2复合材料。反应流程图如图3.3所示，具体操作如下：

①量取所制备的 Au 纳米粒子溶液 0 µL 并向内注入 17.5 µL 正硅酸乙酯，持续搅拌使其充分混合；

②向上述混合液体中分别注入 315 µL Tr-X100 和 310 µL 正丁醇，持续搅拌，该混合液体由分层逐渐转变为均匀透明，形成设计所需的均匀的微乳液体系；

③将 50 µL 浓氨水稀释至 3.95 mL 去离子水中，随后向上述微乳液中缓慢滴加所配置的稀氨水，持续搅拌，时间 20 min，用以进行硅酸乙酯水解；

④将上述反应溶液用作镀膜液体，并滴加至透明玻璃基底表面，40 ℃ 条件下烘干 1 天，该步骤作进一步辅助水解过程；

⑤将所得覆载催化剂材料的玻璃基底进行高温退火处理，温度 500 ℃，持续 3

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小时，随后缓慢冷却至室温，至此即制得所需纳米等离子体催化传感器件。

图4.2AuNPs@SiO2复合材料片制备流程图

Fig4.2.The scheme illustration of the preparation procedure of Au@SiO2 films by drop coating

4.2.4Au@SiO2纳米等离子体薄膜的葡萄糖催化活性实验

如前文所述，为了便于直观的观测到所制备的纳米等离子体薄膜对葡萄糖的催化活性，在此我们选用了基于辣根过氧化物酶（HRP）和显色剂ABTS的比色检测方法对不同尺寸的 Au 纳米等离子体的葡萄糖氧化酶活性进行评估。具体实验步骤如下：

①将所制备的Au@SiO2纳米等离子体薄膜放置于浓度为 10.0 mM 葡萄糖水溶液中，搅拌1分钟，随后在37℃进行孵育，时间为5.0分钟，反应结束后将混合溶液缓慢冷却至室温；

②将磷酸盐缓冲液（pH=7）配置的 HRP 和 ABTS 溶液分别添加到反应完的混合溶液中中，二者终浓度分别为 0.10 mg / mL 和 2.00 mM。反应溶液颜色变蓝，并用自外可见分光光度计对显色产物在 420 nm 处的吸光度进行测量。 ③纳米酶的活性对照实验为在步骤②的基础上，在不实用催化剂材料薄膜的情况下进行，并同样测定 420 nm 处的显色结果。

4.2.5葡萄糖催化氧化的等离子体响应及条件优化实验

将磷酸盐缓冲液溶液注入体积为 3mL 玻璃测量池中。随后，将待测葡萄糖溶液注入反应器中并将传感器薄膜至于反应溶液内。在葡萄糖氧化还原反应发生的最初五分钟内，使用微量光谱仪以0.5秒/次的数据采集频率对 Au 纳米粒子在葡萄糖催化氧化过程中的等离子体振动光谱进行连续的读取、采集。随后根据实际测定结果对反应条件pH、温度等进行进一步的优化。

4.2.6AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜检测葡萄糖

在优化条件下用实验所构建的传感检测系统对一系列浓度水平的葡萄糖溶液进行监测。反应在 37 ℃ 条件下进行 5 分钟，并以 0.5 秒/次的频率对反应过程进行实时对、连续的读取监测。

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4 AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜催化传感葡萄糖的检测

4.2.7模拟样品检测

如前文所述，配备模拟尿酸样品，按照1：100的比例进行稀释，并将稀释后的五个模拟样品进行检测，重复检测3次。

4.3结果与讨论

4.3.1退火温度和时间的影响

图4.3（a）退火温度对薄膜光谱的影响;（b）退火时间对薄膜光谱的影响。

Fig4.3.(a) Effect of Annealing temperature on thin film spectra,(b) Effect of Annealing Time on Thin

Film Spectra.

图4.3是不同退火温度和退火时间制备出的AuNPs@SiO2薄膜的等离子体共振吸收光谱，其中（a）图中红线、黑线、蓝线退火温度分别为400℃、500℃、600℃，而(b)图中黑线、红线、蓝线退火时间分别是3h、4h、5h。退火温度对薄膜的共振吸收光谱的影响较大，温度较低则制备过程中添加的表面活性剂无法除去，图(b)中可见400℃时，光谱的基线较高但较退火之前的光谱基线，说明此时的表面活性剂并未除尽。500℃和600℃时，光谱基线接近，说明表面活性剂基本除尽。然而相较于500℃时，600℃时薄膜的Au等离子体共振峰相对矮而平坦并且发生红移，这主要是因为，在高温退火条件下，小尺寸金纳米粒子阵列熔融状态下发生聚集进而尺寸增大。为不影响后面微型光谱仪信号的采集，我们采用500℃的退火温度。图(b)中可以证实退火时间与退火温度一样因为表面活性剂是否完全除尽以及高温下AuNPs是否发生聚集等对薄膜的共振光谱产生影响。图（b）中可见在退火时间在3小时以上时，光谱基线基本稳定，只是随着长时间的高温条件下，AuNPs发

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生聚集，薄膜的共振吸收峰随着时间的增加，变得越来越平坦，并且发生红移，同样为了后面实验的数据采集，采用退火时间为3小时。

4.3.2AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜的表征

图4.4Au和Au@SiO2复合材料的紫外-可见光谱 Fig4.4.The absorption spectra of Au and Au@SiO2

图4.5 AuNPs@SiO2复合材料XRD图 Fig4.5.The XRD spectra of Au@SiO2

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图4.6(a)-(c)是不同分辨率下AuNPs的投射电镜图，(d)-(e)是不同分辨率下AuNPs@SiO2复合

材料透射电镜图。

Fig4.6.The TEM images of the AuNPs and AuNPs@SiO2 at different resolution.

图 4.4为Au和AuNPs@SiO2纳米等离子体共振吸收光谱，图4.5不同分辨率下Au和AuNPs@SiO2的透射电镜图，图4.5为所制备 AuNPs@SiO2材料的X射线衍射图。通过其 TEM 图像可以看出（参见图4.4 ，黑线部分），所制备的由油胺保护的 Au 纳米粒子尺寸约为 3 nm 左右，并且呈现出了良好的分散性，这一结果符合实验设计预期。因贵金属纳米粒子的 LSPR 共振吸收峰受到其粒子尺寸的影响，所制备的小尺寸 Au 纳米粒子在紫外-可见吸收光谱图上 510 nm 出呈现出了一个相对宽的、平滑的吸收峰信号，正如前文所述较小尺寸的 Au 纳米粒子展现出了极强的催化氧化活性，但其相较于大尺寸粒子所展现的完整且尖锐的特征吸收峰来说，过于平缓和宽的特征吸收峰在一定程度上影响了传感器信号数据的采集。然而，在随后的传感器薄膜制备过程中，3.0 nm Au 纳米等离子体的这一光谱信号得到了有效的改善。如图 4.6所示，通过 TEM 测试发现，在所制备的Au@SiO2纳米等离子体薄膜，极小的 Au 纳米粒子大量均匀的覆载在片状 SiO2 材料中，此外 SiO2 片状结构的尺寸约为 100 nm～150 nm 左右。众所周知，在高温条件下，Au 纳米粒子的稳定性降低成熔融状态并重新聚集导致尺寸增大，但通过薄膜的 TEM 测试可以明显的看出，由于 SiO2 的存在 Au 纳米粒子在高温

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退火处理时并未发生变化，维持了原有的小尺寸结构，这表明作为载体的 SiO2 在一定程度上增加了 Au 纳米粒子的高温稳定性。此外，与单纯的 Au 纳米粒子光谱不同的是，所制备的纳米等离子体薄膜在紫外-可见光谱图上呈现出了一个截然不同的结果。其 Au 纳米等离子体在光谱上出现了一个完整且相对尖锐的特征吸收峰，同时最大吸收波长由之前的 510 nm 红移至 527 nm 处（参见图4.4，红线部分）。这一现象亦可以由前文内容对其进行解释，贵金属纳米粒子的共振吸收光谱除收到其自身尺寸的影响之外，对于纳米粒子阵列而言，相邻金属纳米粒子之间的间距同样能够改变其最终所呈现出来的光谱形状。对于所制备的传感器薄膜而言，SiO2 上所覆载的 3.0 nm Au 纳米粒子可以看作是一个类似阵列的排布，相邻粒子之间因光激发而各自产生 LSPR 效应，同时伴随着粒子之间因相互作用产生近场耦合效应，增强了其所呈现出来的光谱强度及形状。至此，这一现象的出现弥补了小尺寸纳米粒子光谱层面的缺失，并且满足了后续传感检测实验的使用需要。针对片状的 SiO2 结构，其相较于常见的球形 SiO2 颗粒而言，能够提供更大的金属粒子覆载面积，同时避免了因其腔体直径过大而导致大部分所需的金属粒子完全嵌入其中而阻碍其参与反应。基于前人的研究，我们在实验设计中选择了微乳液体系中的 O/W 体系用作Au@SiO2纳米等离子体薄膜制备方案。但后续长时间的高温处理使得 O/W体系逐步转变为连续相体系，片状的 SiO2 结构亦有可能是因为连续相的乳液配比，同时可能带来了特殊的孔状结构，但这一形貌很难通过 TEM 测试表征出来，且对于微乳液体系的使用仍需更进一步的探索。

4.3.3 AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜的葡萄糖氧化酶活性

类似于前文所述，由于葡萄糖和其氧化产物在可见光范围内没有任何的光谱信号，因此我们通过基于HRP的葡萄糖氧化产物，即H2O2，的比色检测来间接评价金纳米粒子的模拟葡萄糖氧化酶的活性。在葡萄糖催化氧化反应之后，加入HRP对其产物过氧化氢进行分解并释放出含有强氧化性的过羟基自由基。随后，羟基自由基进一步对ABTS显色分子进行氧化，通过这一过程可以观察到明显的绿色，其显色产物ABTS+在 420nm 波长有一个强的特征吸收峰，如图 4.7 所示。图中针对 5 mM 葡萄糖的显色结果可以看出，显色剂分子在 420 nm 处展现出了强的光谱吸收信号，这表明所制备的Au@SiO2纳米等离子体薄膜具有葡萄糖氧化酶活性，并满足实验预期。

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图4.7Au@SiO2纳米等离子体薄膜的催化活性。红色曲线是Au@SiO2薄膜催化活性光谱，黑

色实线是空白。

Fig4.7. The catalytic activity of Au@SiO2 film. Red curve for Au@SiO2 film; black curve for the

blank.

4.3.4葡萄糖催化氧化等离子体响应

在本研究实验中，基于金纳米粒子的 LSPR 传感能力提出并建立了一种新的等离子体测定方法以用于对葡萄糖氧化反应进行原位实时检测。在这一传感检测系统中，我们在反应的初始阶段对 AuNPs的等离子体吸收光谱进行连续的测量和数据采集。Au 纳米粒子的等离子体共振吸收峰在 527 nm 和 532 nm 之间（Δλmax= 5.0nm）进行重复的移动，这一现象的出现同样是由于Au 纳米粒子的表面电子在葡萄糖的催化氧化过程中不断的发生注入和消耗所产生的。此外，在没有葡萄糖的空白样品试验中，幅度更小的波动（Δλmax≤2.0nm）不规则地存在。与存在葡萄糖的反应测试中所发生的更大幅度和更为规则的波动（Δλmax= 5.0nm）相比，空白中所出现的即小幅的波动被认作噪音且不被视为有效信号。基于这一传感检测方法，针对反应的pH进行了优化。反应介质的酸度在催化反应中同样起着重要的作用。如图4.8（b）所示，我们测定了在一系列pH值（pH = 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0）的介质中葡萄糖氧化反应的反应频率。由图可以看出，葡萄糖氧化反应在强酸性介质（pH <5.0）和强碱性介质（pH> 9.0）中发均发生了明显的反应抑制现象。于前文所述相似，当反应在较低pH下进行时，葡萄糖氧化反应的抑制现象迅速产生（类似于中间产物葡萄糖酸对反应的抑制作用），同样的，对于碱性介质，Au 纳米粒子表面吸附小的氢氧根离子同样会会阻碍到表面上葡萄糖分子的吸附，进而抑制了反应。在该传感系统中，无论具体的抑制作用是缘何而起，由于传感器信号是从反应的最初始阶段进行采集的，因此不必要的吸附对长时间反应所造成的干扰可以忽略不计。

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图4.8AuNPs@SiO2作传感器(a)摇摆频率与温度的关系；（b）摇摆频率与pH的关系 Fig4.8. AuNPs@SiO2 as a sensor. (a)Dependence of plasmonic cycle on reaction temperature.

(b)Dependence of plasmonic cycle on solution pH.

4.3.5基于纳米等离子催化传感的葡萄糖浓度监测

最后，我们用所提出的基于纳米等离子体的催化传感器初步用于一系列浓度的葡萄糖的检测。传感器信号与葡萄糖水平之间的线性关系且相应葡萄糖浓度检测范围在 50.0 μM 至 15.0 mM 内（R = 0.993）。此外，检测下限约为 20.0 μM，这取决于在单位测量期间（0.5 s）内能够导致单次等离子吸收峰振荡所需的葡萄糖分子的最小浓度。

图4.9等离子体共振频率和葡萄糖浓度的关系。

Fig4.9. Relationship of the plasma resonance frequency with the glucose concentration

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4 AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜催化传感葡萄糖的检测

4.3.6准确度与精密度

表4.1回收率和相对标准偏差 Table4.1.Recovery rate &RSD

No 1 2 3 4 5

加葡萄糖的量（mM）测得葡萄糖的量（mM）回收率，%

1.53 2.28 3.25 3.90 4.

1.527 2.304 3.198 3.987 4.697

99.80 101.05 98.40 102.22 103.46

RSD，%（n=3）

3.53 3.91 2.87 2.75 3.42

根据实验，得上表，并与表2.10进行比较，发现AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜催化传感检测的五个样本的回收率较高，RSD与分散系进行对比，相对偏高，可以认为精密度相对较低，而准确度较高。将Au&AuNPs@SiO2纳米等离子体薄膜与分散系AuNPs进行对比，AuNPs较AuNPs@SiO2检测范围适用于低范围的葡萄糖浓度，灵敏度跟高，准确度和精密度更好，相反AuNPs@SiO2更适合用于大浓度的葡萄糖检测。这可能是由于SiO2纳米粒子过厚，即是硅酸四乙酯的量多造成的。但是制备的纳米等离子体薄膜却可以重复使用45次，基本达到实验的预期，解决了AuNPs大量耗损的现象，降低传感器的成本。

4.4结语

这部分的工作中，成功的将AuNPs大量均应的负载在SiO2纳米材料中，通过滴涂法将复合材料负载在玻璃片上，解决了由于油胺保护的小尺寸AuNPs的等离子体共振吸收峰不完整，不尖锐带来的数据采集困难的问题，并成功用于了葡萄糖浓度的检测。也对检测结果与金纳米等离子体葡萄糖传感器进行简单的对比，讲述利弊，并分析缘由。总的说来AuNPs@SiO2更适合用于大浓度的葡萄糖检测，也没有分散系的灵敏度高。这可能是由于SiO2纳米粒子过厚，即是硅酸四乙酯的量多造成的。但薄膜可重复使用45次，解决了AuNPs大量耗损的现象，降低传感器的成本，基本达到实验预期。

重庆大学硕士学位论文 5 总结与展望

5 结论与展望

5.1结论

创新性的提出并构建了一种基于活性纳米酶的纳米等离子体催化传感器，并通过传感器的优化，成功的应用于了葡萄糖浓度的检测当中。其相较于常规的LSPR检测方法而言，该方法成功的将传感器信号由LSPR吸收峰的直接读取转化为由电子得失所引发的LSPR峰的摇摆频率，这使得能够观测到反应过程中的细小变化。同时，该方法建立在传感器件自身参与催化氧化反应的基础之上，因此无需额外的反应终止步骤，从而实现了对葡萄糖含量的原位实时检测。并且由于其背景信号近乎为零，因此所得的检测结果更为精确。同时，结合之前工作的不足之处，我们对传感器件本身进行了完善，将更小尺寸的 AuNPs覆载于片状 SiO2 载体之上并最终以薄膜的形态展现出来。这一方式不仅避免了催化剂材料的浪费，同时解决了纳米金属粒子在高温处理下的稳定性并保持了良好的催化活性。

5.2展望

本课题中基于金纳米等离子体葡萄糖传感器将纳米金的局域等离子体共振吸收的光学特性和具有拟葡萄糖氧化酶活性的特性相结合，构建纳米等离子体传感器。并运用于葡萄糖的检测和尿酸的检测。基于纳米等离子传感器因为自身具有无需标记、灵敏度高、实时、选择性好、零干扰等系列特点。在生物化学传感、食品药品监控、生态环境等领域具有很好的应用前景。鉴于此，我们构建的基于金纳米等离子体葡萄糖传感器也继承了这些优点。对此课题启发有以下几点：

①本课题中利用构建的传感器对于尿酸的检测的相关研究还有待深入，如尿酸的干扰机理、尿酸检测范围的扩展等。

②从影响LSPR的因素出发，等离子体材料自身因素，除了AuNPs还有Ag、Pt等其他金属粒子；形貌尺寸因素，探究AuNPs的形貌、尺寸的影响。

③从复合的材料出发，有报道的就有石墨烯、碳纳米管等与AuNPs的复合材料，可以考虑其他多孔材料如多孔硅藻泥等。

④从AuNPs的拟人工酶活性看，除了具有拟葡萄糖氧化酶，还有拟过氧化氢酶、拟核酸酶等。

从本课题的横纵方向出发思考，就可以很好的发现一些新课题，纳米等离子体传感器的研究将更加深入。构建各种传感器，将在各领域的实用前景变成现实。

重庆大学硕士学位论文致谢

致谢

推开门窗，闻到飘散在空气中，萦绕四围的栀子花香。又是一年毕业季，多少莘莘学子即将离开他们熟悉校园、离开他们亲爱的老师、离开他们可爱的同学，踏上另一人生路程。特别的是，2018我也是其中一员。回顾往昔，时间飞逝，三年的硕士研究生生活即将划上句号。从备战考研，到研一入学、上课、开题、实验、中期报告等一个个忙碌而充实日子，历历在目，我也从中受益良多。无论是专业技能方面，还是为人处世方面，亦或是个人修养等方面都有很大的提高，并在其中快速成长。

首先，我要特别感谢我的导师莫志宏教授。本课题是在莫志宏教师的指导下完成的，特别是在开题、方案设计以及实验阶段，导师都给予了很大的帮助。莫老师思路清晰、目的明确、经验丰富并且方法科学等特点给我留下了深刻的印象。在生活方面，老师宽以待人严于律己，对我们给予最大的方便和帮助。在学习方面，不吝赐教、循循善诱、授人以渔，让我快速成长，终身受益。

其次，我还要感谢课题组的博士师兄韦正楠。在课题组中，无论老师在或不在，都毫无保留的教我，大到课题的选择，实验方案的设计；小到Origin的使用，数据的处理，实验室的药品、值日等。并且在生活中，待人接物上，身体健康等方面都给予很大的帮助，在此表示由衷的感谢。

同时，我也要感谢课题组的同门周海玲和师姐们师妹们以及师弟。在学习时，提供良好的学习环境。在生活中，提供轻松愉快和谐的氛围。我为这一群志同道合的小伙伴而骄傲，并为此感谢，感谢你们的陪伴。

最后，我要重点感谢我的父母。无论我在生活学习中，遇到什么困难，总能给我无条件的支持和帮助，是我的精神支柱和坚强的后盾。

毕业在即，在今后的工作生活中，我会铭记师长的谆谆教诲，将自己的所用其中，继续不懈努力和追求，来报答所有支持和帮助过我的人！

冷凤

二0一八年五月于重庆

重庆大学硕士学位论文参考文献

参考文献

[1] Manea F, Houillon F B, Pasquato L, et al. Nanozymes: gold-nanoparticle-based

transphosphorylation catalysts[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2004, 43(45):6165-9.

[2] Bonomi R, Selvestrel F, Lombardo V, et al. Phosphate diester and DNA hydrolysis by a

multivalent, nanoparticle-based catalyst.[J]. Journal of the American Chemical Society, 2008, 130(47):15744-5.

[3] Pasquato L, Rancan F, Scrimin P, et al. N-Methylimidazole-functionalized gold nanoparticles as

catalysts for cleavage of a carboxylic acid ester[J]. Chemical Communications, 2000, 22(22):2253-22.

[4] Pengo P, Polizzi S, Pasquato L, et al. Carboxylate-imidazole cooperativity in

dipeptide-functionalized gold nanoparticles with esterase-like activity.[J]. Journal of the American Chemical Society, 2005, 127(6):1616-7.

[5] Dr M C, Dr C D P, Dr R M, et al. The Catalytic Activity of ―Naked‖ Gold Particles †[J].

Angewandte Chemie International Edition, 2004, 116(43):5812–5815.

[6] Comotti M, Cristina Della&#x ;Pina, Falletta E, et al. Aerobic Oxidation of Glucose with Gold

Catalyst: Hydrogen Peroxide as Intermediate and Reagent[J]. Advanced Synthesis & Catalysis, 2006, 348(3):313-316.

[7] Luo W, Zhu C, Su S, et al. Self-catalyzed, self-limiting growth of glucose oxidase-mimicking

gold nanoparticles.[J]. Acs Nano, 2010, 4(12):7451-7458.

[8] Jv Y, Li B, Cao R. Positively-charged gold nanoparticles as peroxidase mimic and their

application in hydrogen peroxide and glucose detection.[J]. Chemical Communications, 2010, 46(42):8017.

[9] He W, Zhou Y T, Wamer W G, et al. Intrinsic catalytic activity of Au nanoparticles with respect

to hydrogen peroxide decomposition and superoxide scavenging[J]. Biomaterials, 2013, 34(3):765.

[10] Lin Y, Ren J, Qu X. Nano‐Gold as Artificial Enzymes: Hidden Talents[J]. Advanced Materials,

2014, 26(25):4200-17.

[11] Dr M C, Dr C D P, Dr R M, et al. The Catalytic Activity of ―Naked‖ Gold Particles †[J].

Angewandte Chemie International Edition, 2004, 116(43):5812–5815.

[12] Xu B, Liu X, Haubrich J, et al. Vapour-phase gold-surface-mediated coupling of aldehydes with

methanol[J]. Nature Chemistry, 2010, 2(1):61.

重庆大学硕士学位论文参考文献

[13] Comotti M, Cristina Della&#x ;Pina, Falletta E, et al. Aerobic Oxidation of Glucose with Gold

Catalyst: Hydrogen Peroxide as Intermediate and Reagent[J]. Advanced Synthesis & Catalysis, 2006, 348(3):313-316.

[14] He X, Tan L, Chen D, et al. Fe3O4-Au@mesoporous SiO2 microspheres: an ideal artificial

enzymatic cascade system.[J]. Chemical Communications, 2013, 49(41):43.

[15] Zheng X, Liu Q, Jing C, et al. Catalytic gold nanoparticles for nanoplasmonic detection of DNA

hybridization[J]. Angewandte Chemie, 2011, 50(50):11994.

[16] Wei H, Wang E. Fe3O4 magnetic nanoparticles as peroxidase mimetics and their applications in

H2O2 and glucose detection.[J]. Analytical Chemistry, 2008, 80(6):2250-4.

[17] Jv Y, Li B, Cao R. Positively-charged gold nanoparticles as peroxidase mimic and their

application in hydrogen peroxide and glucose detection[J]. Chemical Communications, 2010, 46(42):8017.

[18] Wang X X, Wu Q, Shan Z, et al. BSA-stabilized Au clusters as peroxidase mimetics for use in

xanthine detection.[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2011, 26(8):3614-3619.

[19] Liu M, Zhao H, Chen S, et al. Interface Engineering Catalytic Graphene for Smart Colorimetric

Biosensing[J]. Acs Nano, 2012, 6(4):3142.

[20] Zhang Y, Xu C, Li B, et al. In situ growth of positively-charged gold nanoparticles on

single-walled carbon nanotubes as a highly active peroxidase mimetic and its application in biosensing[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2013, 43(1):205-210.

[21] Korsvik C, Patil S, Seal S, et al. Superoxide dismutase mimetic properties exhibited by vacancy

engineered ceria nanoparticles.[J]. Chemical Communications, 2007, 10(10):1056-1058. [22] Pirmohamed T, Dowding J M, Singh S, et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase

mimetic activity[J]. Chemical Communications, 2010, 46(16):2736-8.

[23] He W, Zhou Y T, Wamer W G, et al. Intrinsic catalytic activity of Au nanoparticles with respect

to hydrogen peroxide decomposition and superoxide scavenging[J]. Biomaterials, 2013, 34(3):765-73.

[24] Kisailus D, Najarian M, Weaver J, et al. Functionalized Gold Nanoparticles Mimic Catalytic

Activity of a Polysiloxane‐Synthesizing Enzyme[J]. Advanced Materials, 2005, 17(10):NA-NA.

[25] Manea F, Houillon F B, Pasquato L, et al. Nanozymes: Gold‐Nanoparticle‐Based

Transphosphorylation Catalysts[J]. Angewandte Chemie, 2004, 43(45):6165.

[26] Anderegg F. Chapter 7: Internal Transport in Non-neutral Plasma[M]// Physics with Trapped

Charged Particles:Lectures from the Les Houches Winter School. 2015:195-218.

[27] Cao J, Sun T, Grattan K T V. Gold nanorod-based localized surface plasmon resonance

重庆大学硕士学位论文参考文献

biosensors: A review[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2014, 195(5):332-351.Wang B, Lucia L, Yang R D, et al. Properties of TX-100/n-Butanol/Cyclohexane/Water Microemulsion and Its Osmosis for Wood[J]. Fine Chemicals, 2011, 5(2):197-202.

[28] Willets K A, Duyne R P V. Localized Surface Plasmon Resonance Spectroscopy and Sensing -

Annual Review of Physical Chemistry, 58(1):267[J]. Annual Review of Physical Chemistry. [29] Mayer K M, Lee S, Liao H, et al. A Label-Free Immunoassay Based Upon Localized Surface

Plasmon Resonance of Gold Nanorods[J]. Acs Nano, 2008, 2(4):687-692.

[30] Huang H, He C, Zeng Y, et al. A novel label-free multi-throughput optical biosensor based on

localized surface plasmon resonance[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2009, 24(7):2255-2259. [31] Englebienne P. Use of colloidal gold surface plasmon resonance peak shift to infer affinity

constants from the interactions between protein antigens and antibodies specific for single or multiple epitopes[J]. Analyst, 1998, 123(7):1599-1603.

[32] Haes Amanda J.Hall W.Paige,Chang Lei,Klein William L.,Van Duyne Richard P.A Localized

Surface Plasmon Resonance Biosensor: First Steps toward an Assay for Alzheimer's Disease[J]. Nano Letters, 2016, 4(6):1029-1034.

[33] Sirinakis G, Siddique R, Manning I, et al. Development and characterization of Au-YSZ surface

plasmon resonance based sensing materials: high temperature detection of CO[J]. Journal of Physical Chemistry B, 2006, 110(27):13508-13511.

[34] Langhammer C, Zorić I, Kasemo B, et al. Hydrogen storage in Pd nanodisks characterized with

a novel nanoplasmonic sensing scheme.[J]. Nano Letters, 2007, 7(10):3122. [35] 许春向.生物传感器及其应用[M].北京科学出版社，1993.

[36] Sonesson A W, Callisen T H, Brismar H, et al. Adsorption and activity of Thermomyces

lanuginosus lipase on hydrophobic and hydrophilic surfaces measured with dual polarization interferometry (DPI) and confocal microscopy[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2008, 61(2):208-215.

[37] Ruedasrama M J, Walters J D, Orte A, et al. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing:

a review.[J]. Analytica Chimica Acta, 2012, 751(21):1-23.

[38] Sepúlveda B, Angelomé P C, Lechuga L M, et al. LSPR-based nanobiosensors[J]. Nano Today,

2009, 4(3):244-251.

[39] Nagatani N, Tanaka R, Yuhi T, et al. Gold nanoparticle-based novel enhancement method for

the development of highly sensitive immunochromatographic test strips[J]. Science & Technology of Advanced Materials, 2006, 7(3):270-275.

[40] Wei Z N, Mo Z H, Pu X L, et al. Plasmonic swings during the Fenton reaction: catalytic sensing

of organics in water via fullerene-decorated gold nanoparticles[J]. Chemical Communications,

重庆大学硕士学位论文参考文献

2015, 51(61):12231-12234.

[41] Tittl A, Giessen H, Liu N. Plasmonic Gas and Chemical Sensing[J]. Nanophotonics, 2014,

3(3):157-180.

[42] Chen K J, Lu C J. A vapor sensor array using multiple localized surface plasmon resonance

bands in a single UV-vis spectrum[J]. Talanta, 2010, 81(4-5):1670.

[43] Chen B, Liu C, Xie Y, et al. Localized Surface Plasmon Resonance Gas Sensor Based on

Molecularly Imprinted Polymer Coated Au Nano-Island Films: Influence of Nanostructure on Sensing Characteristics[J]. IEEE Sensors Journal, 2016, 16(10):3532-30.

[44] Nuopponen M, Tenhu H. Gold nanoparticles protected with pH and temperature-sensitive

diblock copolymers[J]. Langmuir the Acs Journal of Surfaces & Colloids, 2007, 23(10):5352-5357.

[45] Sauer V T, Diao Z, Freeman M R, et al. Optical racetrack resonator transduction of

nanomechanical cantilevers.[J]. Nanotechnology, 2014, 25(5):055202.

[46] Jiang H, Markowski J, Sabarinathan J. Near-infrared optical response of thin film pH-sensitive

hydrogel coated on a gold nanocrescent array.[J]. Optics Express, 2009, 17(24):21802-7. [47] Choi Y, Park Y, Kang T, et al. Selective and sensitive detection of metal ions by plasmonic

resonance energy transfer-based nanospectroscopy[J]. Nature Nanotechnology, 2009, 4(11):742. [48] Bhatt K D, Vyas D J, Makwana B A, et al. Highly stable water dispersible calix[4]pyrrole

octa-hydrazide protected gold nanoparticles as colorimetric and fluorometric chemosensors for selective signaling of Co(II) ions.[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy, 2014, 121(121C):94.

[49] Liao W S, Chen X, Yang T, et al. Benchtop chemistry for the rapid prototyping of label-free

biosensors: Transmission localized surface plasmon resonance platforms[J]. Biointerphases, 2009, 4(4):80.

[50] Mayer K M, Hao F, Lee S, et al. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon

resonance.[J]. Nanotechnology, 2010, 21(25):255503.

[51] Zhu S, Du C L, Fu Y. Localized surface plasmon resonance-based hybrid Au–Ag nanoparticles

for detection of Staphylococcus aureus enterotoxin B[J]. Optical Materials, 2009, 31(11):1608-1613.

[52] Yamamichi J, Iida M, Ojima T, et al. The mesoscopic effect on label-free biosensors based on

localized surface plasmon resonance of immobilized colloidal gold[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2009, 143(1):349-356.

[53] Guo L, Chen G, Kim D H, et al. Three-dimensionally assembled gold nanostructures for

plasmonic biosensors.[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(12):5147-53.

重庆大学硕士学位论文参考文献

[] Mayer K M, Lee S, Liao H, et al. A Label-Free Immunoassay Based Upon Localized Surface

Plasmon Resonance of Gold Nanorods[J]. Acs Nano, 2008, 2(4):687-92.

[55] Lee S, Mayer K M, Hafner J H. Improved localized surface plasmon resonance immunoassay

with gold bipyramid substrates[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(11):4450-4455.

[56] Yoo S Y, Kim D K, Park T J, et al. Detection of the most common corneal dystrophies caused

by BIGH3 gene point mutations using a multispot gold-capped nanoparticle array chip[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(4):1349-1357.

[57] Morokoshi S, Ohhori K, Kazuya Mizukami A, et al. Sensing Capabilities of Colloidal Gold

Modified with a Self-Assembled Monolayer of a Glucose-Carrying Polymer Chain on a Glass Substrate†[J]. Langmuir the Acs Journal of Surfaces & Colloids, 2004, 20(20):87-902. [58] Haes A J, Zou S, Zhao J, et al. Localized surface plasmon resonance spectroscopy near

molecular resonances.[J]. Journal of the American Chemical Society, 2006, 128(33):10905-14. [59] Zhao J, Das A, Schatz G C, et al. Resonance Localized Surface Plasmon Spectroscopy: Sensing

Substrate and Inhibitor Binding to Cytochrome P450[J]. J.phys.chem.c, 2008, 112(34):13084-13088.

[60] Wu L, Chu H S, Koh W S, et al. Highly sensitive graphene biosensors based on surface

plasmon resonance[J]. Optics Express, 2010, 18(14):14395-14400.

[61] Zhang H, Sun Y, Gao S, et al. A novel graphene oxide-based surface plasmon resonance

biosensor for immunoassay.[J]. Small, 2013, 9(15):2537–20.

[62] Wang L, Zhu C, Han L, et al. Label-free, regenerative and sensitive surface plasmon resonance

and electrochemical aptasensors based on graphene[J]. Chemical Communications, 2011, 47(27):7794-6.

[63] Mu X, Tong Z, Huang Q, et al. Nano-Magnetic Immunosensor Based on Staphylococcus

Protein A and the Amplification Effect of HRP-Conjugated Phage Antibody[J]. Sensors, 2015, 15(2):36.

[] Barbillon G, Bijeon J L, Plain J, et al. Electron beam lithography designed chemical

nanosensors based on localized surface plasmon resonance[J]. Surface Science, 2007, 601(21):5057-5061.

[65] Wang H, Brandl D W, Le F, et al. Nanorice: a hybrid plasmonic nanostructure[J]. Nano Letters,

2006, 6(4):827.

[66] Bukasov R, Shumakerparry J S. Highly tunable infrared extinction properties of gold

nanocrescents.[J]. Nano Letters, 2007, 7(5):1113-1118.

[67] Zhang Y, Yan M, Gao P, et al. Immobilization of uricase-gold nanoparticles composite

nanomaterial on a biofilm and its application to determination of uric acid[J]. Applied

重庆大学硕士学位论文参考文献

Biochemistry & Microbiology, 2015, 51(4):470-478.

[68] 莫志宏，韦正楠，蒲肖丽.一种Fenton催化纳米等离子体COD传感器及其检测方法.发明

专利，2015100475.X.

[69] Jana N R, Gearheart L, Murphy C J. Seeding Growth for Size Control of 5−40 nm Diameter

Gold Nanoparticles[J]. Langmuir, 2015, 17(22):6782-6786.

[70] Haiss W, Thanh N T, Aveyard J, et al. Determination of size and concentration of gold

nanoparticles from UV-vis spectra.[J]. Analytical Chemistry, 2007, 79(11):4215-4221. [71] Bastús N G, Comenge J, Puntes V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of

citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening.[J]. Langmuir the Acs Journal of Surfaces & Colloids, 2011, 27(17):11098.

[72] Shang L, Liang Y, Li M, et al. ―Naked‖ Magnetically Recyclable Mesoporous Au–γ〧e2O3

Nanocrystal Clusters: A Highly Integrated Catalyst System[J]. Advanced Functional Materials, 2017, 27(9):n/a-n/a.

[73] White R J, Luque R, Budarin V L, et al. Supported metal nanoparticles on porous materials.

Methods and applications.[J]. Chemical Society Reviews, 2009, 40(16):481-94.

[74] Beltrame P, Comotti M, Della Pina C, et al. Aerobic oxidation of glucose[J]. Applied Catalysis

A, 2006, 297(1):1-7.

[75] Abbadi A, Bekkum H V. Highly selective oxidation of aldonic acids to 2-keto-aldonic acids

over Pt—Bi and Pt—Pb catalysts[J]. Applied Catalysis A General, 1995, 124(2):409-417. [76] Zhang L, Zhou N, Wang B, et al. Fabrication of Fe3O4/PAH/PSS@Pd core-shell microspheres

by layer-by-layer assembly and application in catalysis.[J]. Journal of Colloid & Interface Science, 2014, 421(9):1.

重庆大学硕士学位论文附录

附录

A．作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录

[1] 冷凤,莫志宏,王天丽.用于葡萄糖检测的荧光纳米生物传感器[J].中国科技论文在

线,201805-266

[2] Wei,Z.N.,Yang,X.X.,Mo,Z.H.,Leng,F.(2018).Photocatalytic sensor of organics in water with

signal of plasmonic swing.Sensors and Actuators B :Chemical,255,3458-3463.

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