最新 人心房肌Kv1.5钾通道稳定表达细胞系的建立-精品

的建立

作者：赵志敬 王晓斌 穆润花 刘毅 孙冬冬 李志超 王海昌 董明清

【关键词】 ,心肌/细胞学；钾通道；细胞系

【Abstract】 AIM: To establish a cell line stably expressing human cardiac Kv1.5 potassium channel. METHODS: Human cardiac hKv1.5 gene was transfected into HEK 293 cells. G418 at 1 mg/mL was used to select the transfected cells. After 2 weeks for selection, the

antiG418 cell clones were further identified with patchclamp method, and whole cell currents were recorded. RESULTS: hKv1.5 gene was successfully transfected into HEK 293 cells. The expressed hKv1.5 currents were ultrarapid outward currents with obvious

voltagedependence. Its average amplitude was (3.20±0.60) nA and its activation voltage was about -30 mV. CONCLUSION: The cell line stably expressing human atrial Kv1.5 channels has been successfully

established, which has the similar characteristics of human atrial IKur. The established cell line can be used as a cell model for studying in vitro human atrial IKur.

【Keywords】 myocardium/cytology; potassium channels; cell line 【摘要】 目的：建立稳定表达人心房肌细胞Kv1.5钾通道的细胞系. 方法：将编码人心房Kv1.5钾通道的hKv1.5基因转染HEK 293细胞，用1 g/L G418筛选2 wk后采用膜片钳方法筛选具有抗G418抗性的细胞克隆，电流记录模式为全细胞记录. 结果：hKv1.5通道基因被成功转入HEK 293细胞并稳定表达；稳定表达的hKv1.5电流是具有明显电压依赖性和超快激活特点的外向电流，其电流大小为（3.20±0.60）nA，其激活电压在-30 mV左右.结论：成功构建稳定表达人心房Kv1.5钾通道蛋白的HEK 293细胞系，其电流特性与人心房肌IKur相似，可以作为体外研究人心房IKur的细胞模型. 【关键词】 心肌/细胞学；钾通道；细胞系 0引言

超快激活延迟整流钾电流（ultrarapid delayed rectifier potassium current，IKur）是心房肌细胞动作电位复极的主要外向离子流 ［1］. Kv1.5基因编码IKurα亚单位，是IKur的主要分子基础［2－4］，在人的心脏，IKur仅存于心房肌而不存在于心室肌. 因此，IKur是房性心律失常特异性治疗药物的潜在靶位［5-7］. 由于人心肌标本来源困难、心肌细胞多种电流成分相互影响，国内外多采用瞬时转染技术在体外表达离子通道基因来研究人心肌细胞通道功能，而有关稳定转染人hKv1.5通道的细胞系建立的研究报道较少. 我们将人hKv1.5基因转染HEK293细胞，经反复筛选鉴定，成功建立了稳定表达hKv1.5通道的细胞系，其电生理特性与人心房肌细胞IKur相似，是一种较理想的人心房肌IKur细胞模型. 1材料和方法

1.1材料HEK 293细胞系(American Type Culture Collection公司)；

DMEM，Lipofectamine 2000，胎牛血清(Invitrogen公司)；hKCNA5/pBKCMV质粒（带G418抗性基因）由Dr.GR Li (University of )惠赠；G418及其它试剂均购自SigmaAldrich公司；Axopatch200B膜片钳放大器(Axon公司).

1.2方法

1．2．1细胞培养、基因转染及克隆筛选HEK 293细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基于37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养，按照说明书操作步骤用Lipofectamine2000将含有hKv1.5基因的pBKCMV质粒转染至HEK 293细胞，采用G418，免疫荧光染色，膜片钳等方法筛选，鉴定稳定表达人心房肌hKv1.5钾通道蛋白的HEK 293细胞系，具体步骤如下：共转染hKv1.5基因的HEK 293细胞首先用1 g/L G418筛选2 wk，选取具有抗G418抗性的细胞克隆；用膜片钳方法逐个鉴定有无Kv1.5电流表达，将高表达目标电流的克隆在500 mg/L G418的培养液中传代培养，并通过膜片钳方法反复筛选鉴定，最后获得稳定表达Kv1.5通道蛋白的细胞克隆1个，将该克隆维持培养于含 500 mg/L G418,100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养基中.