线粒体抗氧化对神经病理性疼痛大鼠TRPV1表达的影响

锐，张野神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是损伤

(NP)大鼠脊髓水平瞬时感受器电位香草酸受体1 (TRPV1) 表达的影响。方法 清洁级雄性SD大鼠120只，采用随机

或疾病累及包括外周和中枢水平在内的躯体感觉系

统的结果。NP两种主要突出特征是痛觉过敏和自 发疼痛。NP起因广泛,病理生理机制复杂,常规阿 片类药物或非笛体抗炎药治疗效果均不理想［1］&

前期研究［2〕显示线粒体靶向抗氧化剂能有效缓解

数字表法分为3组:假手术组(Sham组,n =40)、神经病理性 疼痛组(NP组,n =40 )、抗氧化治疗组(MT组,n =40 )& NP

组和MT组采用慢性坐骨神经结扎# CCI)制备NP模型。术 后第7天MT组腹腔注射三苯基磷阳离子结合抗氧化剂 (MT)0- 7 my/ky, Sham组和NP组腹腔注射生理盐水，1次/

d,连续14 d&术前及术后第3、7、14、21天时测定机械缩足

大鼠的疼痛行为，与减轻氧化应激水平，改善线粒体

功能有关,但具体机制仍不明确&瞬时感受器电位

反应阈(MWT)和热缩足潜伏期(TWL)，评价疼痛行为。术

香草酸受体 1 ( transient receptvr potential cation chan­

nel ,subfamily V, membar 1 , TRPV1 )是瞬时感受器

前及术后第3、7、14、21天取大鼠L4-6节段脊髓，采用West­

ern blot法测定TRPV1的表达。结果 与Sham组比较,NP

电位(transient receptvr potential, TRP)超家族成员

之一组大鼠术后第3、7、14、21天MWT明显降低(P < 0. 05),

TWL明显缩短(P < 0. 05 ),MT组大鼠术后第3、7天MWT

,主要表达在初级传入感觉神经元上，与痛觉传

递与调制密切相关。激活的TRPV1可以介导P物 质等释放产生痛觉该研究拟探讨线粒体抗氧 化对 NP 大鼠疼痛 TRPV1 的 &1材料与方法1.1实验动物、仪器和试剂 清洁级雄性SD大鼠 120只,6~8周龄,体质量200 -230 y,由安徽医科

明显降低(P<0.05),TWL明显缩短(P<0.05)；与NP组比 较,MT组大鼠术后第14、21天MWT明显升高(P <0. 05),

TWL明显延长(P<0.05)o与Sham组比较,NP组大鼠脊髓 TRPV1表达在术后第7、14、21天明显增加#P<0.05), MT

组大鼠术后第7天脊髓TRPV1表达明显增加(P<0.05)；与

NP组比较,MT组大鼠脊髓TRPV1在术后第14、21天明显

降低#P<0.05)&结论 线粒体抗氧化可以缓解NP大鼠的 疼痛行为,可能与降低脊髓水平TRPV1表达有关。

大学实验动物中心提供。van-Freg触痛仪购自美国

IITC公司；热痛刺激仪(BME-410A)购自北京中国

关键词神经病理性疼痛;线粒体抗氧化；TRPV1 中图分类号 R 741.05文献标志码A 文章编号1000 -1492(2019)05 -0723 -04

doQlO. 19405/j. cnki. issnlOOO - 1492. 2019. 05. 0122019-01 -10 接收医学科学院生物工程研究所;三苯基磷阳离子结合 抗氧化剂(mio-mmpv, MT, sc-221945A)购自美国 Santa Coz公司，-20 C冰箱保存，使用生理盐水稀

释成所需浓度;TRPV1 一抗购自Abnova公司； $-actin —抗、山羊抗鼠IgG二抗购自美国Abeam公

基金项目：安徽省高校自然科学研究项目(编号:KJ2016A327)作者单位:安徽医科大学第二附属医院麻醉科，合肥230601作者简介:孙玉红,女，硕士研究生；司。1.2 NP模型的建立 参考BennPt P /⑷的方法

制备左侧后肢慢性坐骨神经损伤(ch—nic convec­tion inju—,CCI)模型。大鼠称重后，采用腹腔给药

张 野，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail: zhangye_hassan@ sina. comsignificantly lowar than those of tha CIR y—up and tha RES + EX527 y—up ( P < 0. 01 ) - Tha mRNA and p—tein

expressions of FoxOl, IL-1 $, IL-6 and TNF-c in RES y—up were significantly lowar than those in CIR y—up and

EX527 y—up ( P < 0. 01) , while tha pp—ssion of SIRT1 mRNA and p—tein in RES y—up was signi/cantly highar than that in CIR y—up and RES + EX527 y—up ( P < 0. 01) - Conclusion Resverat—i can inhibit tha expression ofFoxOl, reduce tha relexsv of inflammato— factors TNF-c, IL-1 $ and p—mota tha expression of anti-apoptotic faetvr

Bci-2 by activating SIRT1,the—by improving cerebral ischemie/—perfusion damaya in —ts.Key worrs resverat—t ； ischemix-reperfusion inju— ； SIRT1 ； FoxOl・724・安徽医科大学学报 Acta Univefitahs Meeicinalis Anhui 2019 May；(5)戊巴比妥钠(40 ~50 mgky)麻醉。麻醉起效后，在 脱脂牛奶室温封闭1-5 h,加入TRPV1 一抗(1 ：

500), $vcOn — 抗(1 : 1 000 ), 4 Z 孵育过夜。

股骨下方约1 cm平行于股骨切开皮肤，用小剥离子

经股二头肌间隙钝性分离肌肉,暴露坐骨神经,用神

经剥离子轻柔将坐骨神经与周围软组织分离;在坐

TBST液漂洗10 minx 3次，山羊抗鼠IgG二抗(1 :10 000) ,TBST液漂洗10 mid x3次,洗膜后ECL显

骨神经分成三支前的主干部位游离神经7 mm左 色,随后暗室曝光。采用Image J软件进行分析。以

目的蛋白条带灰度值与$-actin条带灰度值的百分 比反映目的蛋白表达水平。右，在距神经起始处(三支分叉处)上方2 mm用4

-0含锯羊肠线结扎坐骨神经4道，每道间隔约1

mm,使被结扎的神经长4~5mm。注意结扎的松紧 1.6统计学处理 采用SPSS 13. 0软件进行统计

度，以打结时可见肌肉轻微抽动为准;局部生理盐水 分析，正态分布的计量资料以i±s表示，大鼠行为

学及蛋白表达比较采用重复测量单因素方差分析, 冲洗,间断缝合肌肉筋膜、皮下组织以及皮肤&假手 术组(Sham组)除不结扎坐骨神经外，其余同模型

组。剔除运动障碍或机械和热刺激无反应的大鼠。1.3实验分组与动物处理所有大鼠饲养在温度、 湿度、灯光受的房间，食物和水充足。采用随机

数字表法分为3组(n = 40 )：假手术组(Sham组)、神

经病理性疼痛组(NP组)和抗氧化治疗组(MT组)， 每组再根据时间点细分为术前、术后3、7、14、21 d，每

组8只大鼠。Sham组和NP组分别于术后7 ~21 d 腹腔注射生理盐水1 ml； MT组于术后7 ~21 d时腹

腔注射三苯基磷阳离子结合抗氧化剂(mito-tempo,

MT)0. 7 mgky(溶于1 mt生理盐水)&1.4疼痛行为学检测1 . 4 . 1 ( mechanicaipaw withdeawaithreshold, MWT)的测定 有机玻璃笼(20 cm x 20

cm x40 cm)置于金属筛网上,大鼠在其中适应环境

15 min,用van-Lreg触痛仪垂直刺激大鼠术侧足底 中部，每足刺激6次，间隔10 s&大鼠会突然缩足或 舔足动作视为阳性反应，记录电子Von Fyg读数, 将6次读数平均值计为MWT,评价机械痛敏&1 . 4 . 2

( theemaipawwithdeawaiiaten-cy,TWL)的测定 在安静的环境中,将大鼠单独放 置 20 cmx20 cmx40 cm 大小 机

,底为厚0.2 mm玻璃,光源自动切断时间为20 s,以

防止足底烫伤&待大鼠适应环境15 min后，光辐射 热照射足底表面，每足照射3次，间隔5-10 min, 20 s内缩足视为阳性，记录从照射到缩足的时间,3

次时间的平均值即为TWL,评价热痛敏&1.5 脊髓TRPV1表达的测定 采用Westem blot

法进行测定。每组行为学结束后随机处死3只大

鼠，取L4-6节段脊髓组织，加入RIPA裂解液于冰

上匀浆,4 Z、12 000 Pmin离心30 min,取上清液,

采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经

丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至PVDF膜上，用8%

P <0. 05为差异有统计学意义&2结果2.1线粒体抗氧化对大鼠机械触痛的影响与

Sham组比较,NP组术后第3、7、14、21天MWT明显

降低(3 =46.47, P < 0. 05) ； MT 组术后第 3、7 天 MWT 明显降低(3 = 30- 49, P < 0. 05 )；与 NP 组比

较,MT组术后第14、21天MWT明显升高(3 =

39. 6,P <0.05)。见图 1A&2.2线粒体抗氧化对大鼠热触痛的影响与Sham

组比较,NP组术后第3、7、14、21天TWL明显降低 (3=68.87 ,P<0.05) ；MT 组术后第 3、7 天 TWL 明

显降低(3 = 27- 98,P<0.05)；与NP组比较,MT组

术后第14、21天TWL明显升高(3 =48.56, P < 0.05)。见图 1B&2.3 线粒体抗氧化对TRPV1表达的影响与

Sham

,NP 脊髓 L4 -6 节

第 7、14、21天时TRPV1表达明显上调(P<0. 05),且于

术后第14天达峰值;MT组TRPV1表达在术后第7

； NP

, MT TRPV1后第14、21天明显降低(P<0. 05)，术后第3、7天

差异无统计学意义(P>0.05)。见表1 &3讨论NP有机械触痛、热触痛等明显特征& 一旦外周

神经受损，一系列病理生理改变将会产生。本研究

通过制造大鼠CCI模型，行为学测试表明机械触痛

及热触痛阈值明显降低，表明NP模型建立成功。线粒体是自由基的主要来源，也是自由基攻击

的目标，神经损伤后自由基过度产生可引起线粒体

氧化应激、结构和功能异常，导致线粒体能量产生障 碍。线粒体靶向抗氧化剂可以被线粒体有效摄取, 缓解线粒体氧化应激［5］。前期研究［2〕显示，与对照安徽医科大学学报 Act Universitatis Meacinalis Anhui 2019 Mvy；(5)表1三组大鼠脊髓TRPV1表达水平的比较（n = 3,1 土 +组别-725 -1d0.196 ±0.0070.193 ±0.0163d0.212±0.0377d0.201 ±0.0170.381 ±0.012 *14 d0.211 ±0.01921 d0.193 ±0.017ShamNPMT0.287 ±0.0170.292±0.0070.0 ±0.015 *0.381 ±0.020 *0.181 ±0.0100.409 ±0.025 *197.2000.253 ±0.011#179.4000.001 20.310 ±0.013#97.8000.001 63值2.5710.248 18.6010.099 0P0.000 3与Sham组比较：* P<0.05 ;与肝 组比较:#P<0.05痛。长春新碱抗 治疗不可避 会 周神病变，研究［7］示长春新碱诱导的NP大鼠小背 B20r -Sham组-B-NP组MT组*术前1 d术后3d术后7d术后14d术后21 d图1 3组大鼠各时间点机械触痛及热触痛A：3组大鼠各时间点机械触痛；B：3组大鼠各时间点热触痛；与Sham 组比较：* P<0. 05；与 NP 组比较:# P< 0. 05，慢坐 疼痛大鼠脊髓线粒体融合视

萎缩

1、粒体融合

1表，

粒体动

、 高，线粒体抗氧化治

，线粒体融合 对

无

&[6],大鼠NP建立后每 0.7 my/kg的MT,实验结果也证实抗氧化治疗能明显改善 NP大鼠的疼痛阈值。线粒体抗氧化治

逆转慢性坐

痛大鼠脊髓TRPV1 的上调&这结果提示MT 抑制脊髓TRPV1的表达来

镇痛作用。TRPV1作一种非 子 ，可能被大量生理或化学刺 &

[7]称TRPV1在神元上 导致 病变。很多研究[8'9]实TRP通道涉

杉醇或奥

•诱导的神经性疼根 节 元上TRPV1 会 & TR-PV1

导致长春新 诱导的 疼痛的生发展。本实验

示NP大鼠脊髓TRPV1叢;抗 化治

，TRPV1 ，说明TRPV1

慢性坐骨神经痛的发展。粒体抗氧化治 轻NP的具体机制尚未明确。期研究［2］ 粒体抗氧化治 NP大鼠氧化 水平， 粒体功能。其他抗氧化剂如迷迭香酸， 抑制

因子(tumvrnec—sis factvr-Q，TNF—)、诱导型一氧化氮合酶、凋

亡因子来减轻慢性坐

痛大鼠的疼痛阈值［10］&也有研究［11］

炎症因子TNF可使TRPV1 上生疼痛，

抗TNF生物制剂

缓解疼痛。本研究

NP大鼠线粒体靶向抗氧化治疗，TRPV1

&

粒体抗氧化治疗是否缓 化应激，减轻炎症

来调节TRPV1的还需一步研究。上 ，线粒体抗氧化

慢性坐骨大鼠的疼痛 ；NP的发生发展与TR-

PV1

， 粒体抗 化治TRPV1表达， 成 NP治疗的新靶点。参考文献(1) Smith T E，Chong M S- Neuropathic pain (J) - Hosp Med, 2000，

61(11) ：760 -6.(2) Zhan L，Li R，Sun Y，et al. Effect of mito - TEMPO，a mito­

chondria -targeted antioxidant，in rats with neuropathic pain(J)-

Neu— Rep-o, 2018,29(15) ：1275 -81.(3) Utsumi D , Matsumoto K, Tsukahare T, et al. Transient receptor

potential van/loid 1 and transient receptor potential ankyrin 1 con-

tnbute to the progression of colonic inflammation in dextran sulfate sodium - induced colitis in mice: Links to calcitonin gene - related

peptide and subsPnce P( J) - J Pharmacol Scl, 2018 , 136 (3 ):

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produces disorders of pain sensation like those seen in man (J)-

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expretnonnnnesropathncpannrattSun Yuhong, LiRui, ZhangYe(Dept of Anesthesiology, The Second AfCated Hospital of Anhut MePical University, Hefei 230601)

Abstract Objective To evaluate the effect of mi/chondPa 一 targeted antioxidant on transient receptor potentialcation channel, subfamily V, member 1 ( TRPV1) expression in neuropathic pain ( NP) rats. MeCiods 120 male

Speague-Dawieyeatsweeeeandomiydieided into3 geoups ( n =40 each) using a eandom numbe etab ie：sham ope ea- tion group ( Sham group ) , neuropathic pain group ( NP group ) , mitochondrial antioxidant treatment group ( MT gmup) - Neuropathic pain was induced by chronic constP/hn injuy in NP and MT gmups. Starting from 7 th day

after operation, mih-tempo (tophenylphosphine cation combined with antioxidant) 0. 7 mg/kg in lml of novnal sa­line was injected intrapePtonea/y once a day far 14 consecutive days in MT gmup, and the equal volume of nopnal sa/ne was given once a day for 14 consecutive days in Sham and NP gmups. On 1 day before operation and 3 ,7,14

and 21 days a/vr operation, the mechanical paw withdrawal threshold ( MWT) and thevnal paw withdrawal latency (TWL) were measured. Lumbar 4-6 segments of the spinal cord were hamested tv detect the expression of TR-

PV1 ( by Western blot) before operation and on days 3 ,7,14 and 21 after operation. Results Compared with groupSham, the MWT and TWL in NP group were signiUcontly decreased on the 3rd,7th, 14th and 21st day a/vr opera­

tion ( P < 0. 05 ) , the MWT and TWL in MT group were signiUcontly decreased on the 3rd and 7th day after opera­tion ( P < 0. 05 ) ； Compared with group NP, the MWT and TWL in MT group were signiUcontly increased on the 14th and 21st day a/vr operation ( P < 0. 05 ) - Compared with group Sham, the expression of TRPV1 in NP group

was signOicontly increased on the 7th, 14th and 21st day a/vr operation ( P < 0. 05 ) , the expression of TRPV1 in MT group was signiUcontly increased on the 7th day after operation( P < 0. 05 ) ; Compared with group NP, TRPV1 expression in MT gmup was signUicontly deceased on the 14th and 21st day after operation ( P < 0. 05 ) - Conclusion

The mechanism by which mitochondrial antioxidant treatment increases behavior threshold may be related h TR- PV1 eipeesin eeductin.Key word neuypathic pain ； mitochondPa-targeted antioxidant; TRPV 1