安徽科技学院学报，２０１１，２５（６）：１－５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＭＴ对体外培养松果体细胞ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ表达的影响 吕锦芳 ，姜锦鹏 ，饶开晴 ，倪迎冬 ，顾有方 ，应如海 ，宁康健 （１．安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳２３３１００；２．西南民族大学，四川成都６１００４１； ３．南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室，江苏南京２１００９５） 摘要：通过胶原酶、胰蛋白酶双消化法获取蛋鸡松果体细胞，分为对照（培养基）、酒精（溶剂对照）和褪 黑素（ＭＴ）三组进行原代细胞培养，采用相对定量ＲＴ—ＰＣＲ方法检测褪黑素（ＭＴ）对培养的松果体细胞促 性腺激素释放激素一Ｉ（ＧｎＲＨ—Ｉ）基因表达的影响。结果表明：ＭＴｒ检测丘：常培养的松果体细胞增殖速 度第９ｄ达高峰，１ｌｄ缓降。与对照组比较，ＭＴ处理１周显著上调其表达丰度（Ｐ＜０．０５）；与酒精溶剂组相 比，ＭＴ处理１周具有上调其表达的趋势（Ｐ＜０．１）；对照组与酒精组之间没有明显的差异（Ｐ＞０．０５）。从 而提示：体外培养松果体细胞的ＧｎＲＨ表达受ＭＴ的。 关键词：促性腺激素释放激素一Ｉ；褪黑激素；松果体细胞；ＩＳＡ褐蛋鸡 中图分类号：￥８１４．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—８７７２（２０１１）０６—０００１—０５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ０ｆ ＭＴ ｏｎ ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ—ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｉｎｅａｌｏｃｙｔｅｓ ＬＶ Ｊｉｎ一 ，ＪＩＡＮＧＪｉｎ一 ，ＲＡＯ Ｋａｉ一耐，Ｍ Ｙ＇ｍｇ一 ，Ｃｕ Ｙｏｕ一 ，ＹＩＮＧ ｍ—ｈａｉ ， －ｊｉ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｈｕｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｅｎｇｙａｎｇ ２３３１００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｏｕｔｈ— ｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌａｙｅｒ ｐｉｎｅａｌｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃｏＵａｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｔｒｙｐｓｉｎ，ａｎｄ ｃｅＨｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｍｅｄｉｕｍ），ａｌｃｏｈｏｌ（ｓｏｌｖｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏ１），ａｎｄ ＭＴ（ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｃｏｈｏ１）ｇｒｏｕｐ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ（ＭＴ）ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ‘ＧｎＲＨ—Ｉ ｇｅｎｅ ｉｎ ｌａｙｅｒｓ ｐｉｎｅａｌｏｃｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ ｏｎ １ ｌ ｔｈ ｄａｙ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ＲＴ —ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｂ～ａｃｔｉｎ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏ１．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌ￣ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｈｔｅ ＭＴｒ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｉｎｅａｌｏｃｙｔｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ ｆｒｏｍ １ ｔｏ ９ ｄａｙｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ ｈｔｅｒｅ ｗａｓ ａ ｂｉｔ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｎ ｔｈｅ １ｌｔｈ ｄａｙ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ ｄａｙ．Ｔｈｅ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ ｉｎ ＭＴ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｓｉｎｇｉｉｆｅａｎｄｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｈｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｆＰ ＜０．０５），ａｎｄ ｓｔｉｌｌ ｈａｓ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｎｄ ｂｙ ＭＴ ｒｔｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｅｖｅｎ ｄａｙｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｈｔ ａｌｃｏｈｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．１），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｎｇｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＞０．０５）． ｈＴｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＧｎＲＨ—Ｉ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌａｙｅｒ ｐｉｎｅａｌｏｅｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｕｐ —ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＭＴ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＧｎＲＨ—Ｉ；Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ；Ｐｉｎｅａｌｏｃｙｔｅ；ＩＳＡ ｂｒｏｗｎ ｌａｙｅｒｓ 松果体是一个古老的器官，主要分泌吲哚类、多肽类激素，其中最重要的是褪黑素（Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ，ＭＴ）。 ＭＴ作为一个广泛分布和功能多样化的分子，具有多种重要的生物学功能，除已经被阐明的视网膜和松果 收稿日期：２０１０—１２—１０ 基金项目：安徽科技学院重点学科建设项目（ＡＫＸＫ２０１０１—２）。 作者简介：吕锦芳（１９５６一），女，安徽省凤阳县人，学士，教授，主要从事动物生长与生殖研究。 ２ 安徽科技学院学报 ２０１１矩 体生物时钟的信号处理，生理节奏的产生外，对机体免疫、生殖功能等都具有重要的调节作用…。据 报道ＭＴ具有抗衰老作用，人和恒河猴的衰老过程中均伴随血浆中ＭＴ水平的降低和激素昼夜释放的振 幅下降 Ｊ。Ｏｈｍ认为，ＭＴ是抑制鸟类性腺功能的因素之一 Ｊ。夏银，何兰花等用ＭＴ主动或被动免疫蛋 鸡和蛋鸭可显著提高其生殖内分泌水平，显然ＭＴ通过生殖轴的对蛋禽生殖功能起到抑制作用【４’ 。 松果体内还存在着丰富的促性腺激素释放激素（ｇａｎｏｄｏｔｒｏｐｈｉｎ—ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ，ＧｎＲＨ）样肽 Ｊ，目 前关于ＧｎＲＨ样肽的来源、作用等并不清楚。有报道，在体试验ＭＴ可以生殖轴的上游激素ＧｎＲＨ的 释放 】，至于松果体内ＭＴ对ＧｎＲＨ样肽的分泌影响及是否存在互作关系等至今尚不明确。本文通过体 外细胞培养，观察了蛋鸡松果体细胞ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ的表达，并初步探讨了外源性ＭＴ对松果体细胞Ｇｎ— ＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ表达的调节作用。 １材料与方法 １．１主要仪器和试剂 ＣＯ 培养箱（ ｅ珊ｏ，美国），自动酶标仪（Ｔｅｃａｎ，澳大利亚），ＡＬＤ１２４４ ＰＣＲ仪（ＢＩＯ ＲＡＤ，美国），生 物分光光度计（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ８．５ｍｍ，德国），凝胶电泳成像分析系统（日本Ｋｏｄａｋ １Ｄ Ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｄｏｃｕｍｅｎ— ｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ １２０）。ＤＭＥＭ培养基、胰蛋白酶和胶原酶（ＧＩＢＣＯ，美国），胎牛血清（兰州民 海），ＭＴ（Ｓｉｇｍａ，美国），总ＲＮＡ提取试剂盒（ＴＲＮｚｏｌ，ＴＩＡＮＧＥＮ，北京），Ｍ—ＭＬＶ（Ｐｍｍｅｇａ，美国），随机引 物及ＲＮＡａｓｅ抑制剂（南京生兴），Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶及ＰＣＲ试剂（ＴａＫａＲａ，大连）等。 １．２松果体细胞的获取及体外培养 ２ｌ周龄健康ＩＳＡ褐蛋鸡４０只，断颈宰杀，酒精消毒，无菌条件剥离颅骨，游离松果体。松果体细胞分 离、培养和形态鉴定参照文献 Ｊ。彻底剥除外膜及血管，立即放人冷双抗Ｄ—ｈａｎｋｓ液洗涤并剪碎，０．１％ 胶原酶（Ⅱ型）消化１５ｍｉｎ、０．２５％胰蛋白酶消化１５ｍｉｎ后，血清中和，反复吹打，１００目过滤，滤液离心，重 新悬浮，吹打均匀，用ＤＭＥＭ细胞培养液将细胞密度调为１×１０ ／ｍＬ，分别接种于９６孔（用于细胞活力检 测，共５块，每块接６孔）和２４孔板（用于试验处理，共３块），细胞置于３７￣Ｃ、５％ＣＯ 孵箱内静置培养。 于培养的第５ｄ将每块培养板（２４孑Ｌ）的细胞分为培养基对照组（仅培养基）、溶剂对照组（含１／３００（ｖ／ｖ） 的无水乙醇培养基）、和浓度为１０。ｍｏｌ／Ｌ的ＭＴ组（溶于１／３００（ｖ／ｖ）的无水乙醇），隔日更换培养液，各 组第１１ｄ收集培养的松果体细胞，用其提取总ＲＮＡ（ｎ＝３，每个样由２４孔培养板的８孔培养物合并）。 １．３ ＭＴｒ检测 于培养的第３ｄ开始，隔日取９６孑Ｌ板一组共６孔细胞用于细胞活力检测，每孔先弃去２０ｔ￣Ｌ培养液，加 入ＭＴＹ液２Ｏ Ｌ，孵箱内继续孵育４ｈ后，弃去培养液，每孔加入１５０Ｉ￣Ｌ ＤＭＳＯ，显色１０ ｍｉｎ，振荡１０ｍｉｎ，酶 标仪测ＯＤ值（波长５７０ｎｍ）。测至１ｌｄ。 １．４引物设计与合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ检索的鸡ｐ—ａｃｔｉｎ ＤＮＡ序列（Ｘ００１８２）、鸡ＧｎＲＨ—Ｉ ｃＤＮＡ序列（Ｘ６９４９１），使用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件设计引物（见表１），由南京皓嘉生物技术有限公司合成。 表１ ＧｎＲＨ—Ｉ与１３～ａｅｔｉｎ目的基因引物参数 Ｔａｂｌｅ １ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｆｏｒ ＧｎＲＨ—Ｉ ａｎｄ Ｂ—ａｅｔｉｎ 注：Ｆ：上游Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｒ：下游Ｒｅｖｅｒｓｅ． １．５总ＲＮＡ提取和反转录 总ＲＮＡ提取和质量鉴定：使松果体细胞悬浮于Ｔｒｉｚｏｌ试剂中，反复吹打，收集细胞，按试剂盒提供方 法提取总ＲＮＡ。生物分光光度计测定总ＲＮＡ浓度和纯度（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０：１．８—２．０）。取２ ｇ总ＲＮＡ， ４ 安徽科技学院学报 表２不同培养时间松果体细胞ＭＴｒ值 Ｔａｂｌｅ ２ ＭＩＴ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｉｎｅａｌｏｃｙｔｅｓ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（±Ｓ，ｎ＝６） ２０１１年 叠０Ｉｓ８＆ ０《Ｚ 基 口ｕ绉 ＼Ｈ．墨考 注：小写字母不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５），下同。 ２．３ ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ的表达 由图２显示：体外培养的松果体细胞存在丰富的ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ的表达，与空白对照组比较，ＭＴ处理ｌ 周显著上调其表达丰度（Ｐ＜０．０５）；与酒精溶剂组比较，ＭＴ处理１周具有上调其表达的趋势（ｐ＜０．１）。 Ａ Ｄ２０００ 酒精 ＭＴ 对照 ・一１３．ａｃｔｉｎ ２５０ｂｐ－￣ —・Ｇｎ删１・６ １．４ ｌ＿２ ｌ 一 薹ｏ．８ ０ Ｏ・６ Ｏ．４ ０．２ ０ 对照组 酒精组 Ｍ’Ｉ’组 图２ ＭＴ对体外培养的松果腺细胞ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ表达的影响 Ａ：ＰＣＲ产物２．Ｏ％ＥＢ凝胶电泳分析图；Ｂ：结果统计图 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＭＴ ｏｎ ＧｎＲＩ－Ｉ—Ｉ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｉｎｅａｌｏｃｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａ：ＥＢ ａｇ￣ｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＴ—ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｂ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ３讨论 此次培养初期观察到的松果体细胞形态学特征与Ｗａｔａｎａｂｅ等［９ 观察到的体外培养鸡胚松果体细胞 情况有许多共同之处。如，初期松果体实质细胞呈圆形或多角形，有强折光性，胞质较少，成纤维细胞的存 在，偶见松果体细胞有聚集成簇生长等。 已有研究证实，鸭和蛋鸡松果体内存在着丰富的ＧｎＲＨ ｍＲＮＡ的表达，从而提示松果体细胞可能具有 合成ＧｎＲＨ的能力ｕ。。。本实验体外培养的松果体细胞也存在ＧｎＲＨ ｍＲＮＡ的表达，与上述结果是一致 的。推测体外培养的松果体细胞已不存在完整的神经元，若存在部分神经纤维也不可能在体外培养的条 件下增殖和进行分泌活动，因此，可以初步排除松果体接受颈交感神经支配以及脑内含ＧｎＲＨ阳性纤维偶 尔也投射到松果体¨ｕ的可能性分泌。然而关于松果体细胞是否真正具有合成ＧｎＲＨ的能力尚待进一步 定性研究。 以往的研究还显示，ＧｎＲＨ可以刺激松果体ＭＴ的释放 。对性腺机能减退小鼠的研究发现，ＧｎＲＨ 第２５卷第６期 吕锦芳，等ＭＴ对体外培养松果体细胞ＧｎＲＨ—ｌ ｍＲＮＡ表达的影响 ５ 具有下调ＭＴ受体基因表达的作用¨引，提示ＧｎＲＨ对ＭＴ及其受体水平具有调节作用。此外，ＭＴ对Ｇｎ－ ＲＨ水平也具有调节作用，ＭＴ具有明显的抑制生殖功能的作用，可直接作用于脑内视交叉上核抑制ＧｎＲＨ 的释放，降低血清中黄体生成素（ＬＨ）和卵泡刺激素（ＦＳＨ）的水平，从而抑制生殖活动 ¨。然而，ｕ等研 究报道，ＭＴ处理老年雌性大鼠可诱导下丘脑ＧｎＲＨ ｍＲＮＡ的表达增加１８％Ｄ４］，这些研究结果提示在体 ＭＴ处理对生殖轴途径的ＧｎＲＨ ｍＲＮＡ表达有调节作用，且影响是因动物或年龄而异，当然以上研究结果 的差异不排除可能所采用的检测方法不同而导致。 迄今，松果体内的ＭＴ与ＧｎＲＨ样肽的分泌关系未见报道。此次观察到外源性ＭＴ对体外培养的松果 体细胞ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ的表达具有一定的上调作用。关于ＭＴ影响的量一效关系、动物年龄的差异等值 得继续观察。由于缺乏禽类特异性的ＧｎＲＨ抗体，ＭＴ对松果体细胞ＧｎＲＨ蛋白含量的影响仍有待研究。 参考文献： ［１］Ｒｅｉｔｅｒ ＲＪ，Ｔａｎ ＤＸ，Ｆｕｅｎｔｅｓ—Ｂｒｏｔｏ Ｌ．Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ：Ａ Ｍｕｌｔｉｔａｓｋｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ［Ｊ］．Ｐｒ叼嘲８ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，１８１（５）： １２７—１５１． ［２］Ｋｏｒｋｕｓｈｋｏ ＯＶ，Ｌａｐｉｎ ＢＡ，Ｇｏｎｅｈａｒｏｖａ ＮＤ，ｅｔ １ａ．Ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｔｈｅ ｐｉｎｅａｌ ｇｌａｄ ｐｅｐｆｉｄｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄａｉｌｙ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ｒｈｙｔｈｍ ｉｎ ｄｄ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｎｄ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐｅｏｐｌｅ［Ｊ］．Ａｄｖ Ｇｅｍｎｔｏｌ，２００７，２０（１）：７４—８５． ［３］Ｏｈｔａ Ｍ，Ｋａｄｏｔａ Ｃ，Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｈ．Ａ ｒｏｌｅ ｆｏ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅ ｆｏ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｓｍ ｉｎ ｈｔｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｑｕａｉｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｆｏ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９８９，加：９３５—９４１． ［４］夏银，汪兴生，杨利国．褪黑激素主动免疫对蛋鸡生殖内分泌的影响［Ｊ］．南京农业大学学报，１９９６，１９（３）：７５—７８． ［５］何兰花，田允波，薛立群，等．褪黑激素被动免疫对母鸭性激素的影响［Ｊ］．南京农业大学学报，１９９６，１９（３）：７５－７８． ［６］叶丹，潘建伟，廖鸣娟，等．促性腺激素释放激素的结构及其生物学功能［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２００３，３０ （１）：４９—５３． ［７］Ｒｅｉｔｅｒ ＲＪ．Ｔｈｅ Ｐｉｎｅａｌ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ ｈｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｔｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｓ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９８０，１（２）：１０９ —１３１． ［８］廖华，徐达传．原代培养大鼠松果体细胞的增殖与分化一免疫组织化学研究［Ｊ］．中国组织化学与细胞化学杂志，２００３， ｌ１（１）：３２—３５． ［９］Ｗａｔｎａａｂｅ Ｋ，Ａｒａｋｉ Ｍ，１ｗａｓａｋｉ Ｈ．Ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐｉｎｅａｌ ｂｏｄｙ ａｓ ａ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｏｒｇａｎ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈ－ ｉｎｑｕｅ，１９９２，２１：２１８． ［１Ｏ］倪迎冬，周玉传，卢立志，等．下丘脑ＧｎＲＨ—Ｉ ｍＲＮＡ在绍兴鸭松果腺中的表达［Ｊ］．南京农业大学学报，２００４，２７ （４）：１３５—１３７． ［１１］Ｇｒｅｅｎ ＣＢ，Ｂｅｓｃｈａｒｓｅ ＪＣ，Ｚａｔｚ Ｍ．Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌｓａｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉｎａ ｃｌｃｏｋ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｎａｄ ｃＡＭＰ ｉｎ ｃｈｉｃｋ ｐｉｎｅａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｒｉａｎ Ｒｅｓ，１９９６，７３８（１）：１－７． ［１２］ｈｏｈＭＴ，ＨｏｓａｋａＴ，ＭｉｍｕｒｏＴ，ｅｔａ１．Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ—ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅｉｎｃｒｅｓａｅｓｍｅｌａｔｏｎｉｎ ｒｅｌｅａｓｅｉｎｔｈｅ ｐｉｎｅａｌ ｓｈｎｄ ｏｆｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔ ｉｎ ｉｆｔｒｏ［Ｊ］．Ｈｏｒｍ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ，２００３，３５（３）：１５３—１５７． ［１３］Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＪＤ，Ｍｅｓｓａｇｅｒ Ｓ，ＥｂＨｎｇ ＦＪ，ｅｔ １ａ．Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ—ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｄｒｉｖｅｓ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ￣ａｎｄ［Ｊ］．Ｐｒｃｅ Ｎａｔ１ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００３，１００（５）：２８３１—２８３５． 【１４］Ｉｊ Ｓ，Ｇｉｖａｌｏｉｓ Ｌ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｇ．Ｅｆｆｃｅｔｓ ｆｏ ａｇｉｎｇ ｎａｄ ｍｄａｔｏｎｉｎ ａｄｍｉｉｎｓ￣ａｉｆｏｎ ｏｎ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ—ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅｓ（ＧｎＲｔｔ） ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｔｅ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｍｔ［Ｊ］．Ｐｅｐｆｉｄｅｓ，１９９７，１８（７）：１０２３—１０２８． （责任编辑：顾有方）
